Quantifizierung der Dopaminergen Neuron morphologische Veränderung und Degeneration bei Caenorhabditis elegans
Summary
In diesem Artikel zeigen wir, wie man ein Sieben-Punkte-Scoring-System verwendet, um Veränderungen der dopaminergen Neuronen-Dendritenmorphologie bei C. eleganskonsistent zu quantifizieren. Dieses System ist für die Analyse dopaminerger Neurodegenerationsassays unter Verwendung genetischer, chemischer und altersbasierter Modelle neurodegenerativer Erkrankungen vorgesehen.
Abstract
Dopamin-Neuronenverlust ist an der Pathologie der Parkinson-Krankheit (PD) beteiligt, einer weit verbreiteten neurodegenerativen Erkrankung, von der weltweit über 10 Millionen Menschen betroffen sind. Da viele Details über die PD-Ätiologie unbekannt bleiben, sind Studien, die genetische und umweltbedingte Beiträge zur PD untersuchen, erforderlich, um Methoden der Prävention, des Managements und der Behandlung zu entdecken. Die richtige Charakterisierung des dopaminergen neuronalen Verlusts kann nicht nur für die PD-Forschung, sondern auch für andere zunehmend verbreitete neurodegenerative Erkrankungen relevant sein.
Es gibt etablierte genetische und chemische Modelle der dopaminergen Neurodegeneration im Caenorhabditis elegans-Modellsystem, mit einfacher Visualisierung der Neurobiologie, die durch die Transparenz und invariante neuronale Architektur der Nematoden unterstützt wird. Insbesondere die morphologischen Veränderungen der dopaminergen Neuronen von C. elegans durch hermaphroditische C. elegans können mit Hilfe von Stämmen mit fluoreszierenden Reportern visualisiert werden, die von zellspezifischen Promotoren wie dem dat-1-Dopamintransporter-Gen angetrieben werden, das ausschließlich in ihren acht dopaminergen Neuronen exprimiert wird.
Mit den Fähigkeiten dieses Modellsystems und der entsprechenden Technologie haben viele Labore die dopaminerge Neurodegeneration untersucht. Es gibt jedoch wenig Konsistenz in der Art und Weise, wie die Daten analysiert werden, und ein Großteil der vorliegenden Literatur verwendet binäre Scoring-Analysen, die das Vorhandensein von Degeneration erfassen, aber nicht die vollständigen Details des Fortschreitens des Neuronenverlusts. Hier stellen wir ein universelles Scoring-System vor, um morphologische Veränderungen und Degeneration in dendriten des Kopfneurons von C. eleganszu beurteilen. Diese siebenstige Skala ermöglicht die Analyse eines vollständigen Spektrums der Dendritenmorphologie, von gesunden Neuronen bis zum vollständigen Dendritenverlust und unter Berücksichtigung morphologischer Details wie Knicke, Verzweigungen, Blasen und Brüche. Mit diesem Scoring-System können Forscher subtile altersbedingte Veränderungen sowie dramatischere chemisch induzierte Veränderungen quantifizieren. Schließlich stellen wir einen Übungssatz von Bildern mit Kommentaren zur Verfügung, die verwendet werden können, um die Scoring-Konsistenz von Forschern, die neu in dieser Methode sind, zu trainieren, zu kalibrieren und zu bewerten. Dies sollte die Konsistenz innerhalb und zwischen dem Labor verbessern und die Strenge und Reproduzierbarkeit erhöhen.
Introduction
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine immer häufiger auftretende neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit bis zu 10 Millionen Menschen betroffensind 1. Männer und ältere Personen haben ein höheres Risiko für die Entwicklung von PD; Das durchschnittliche Erkrankungsalter beträgt 60 Jahre, und die Inzidenz von Parkinson steigt von einer Inzidenz von 0,3% in der Allgemeinbevölkerung auf 3% bei Personen über 80 Jahren im Alter von1,2. Obwohl die Details der PD-Pathologie nicht vollständig verstanden werden, beinhaltet diese fortschreitende Störung den Verlust von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra-Region des Mittelhirns. Hypothetische Mechanismen dieses neuronalen Verlusts beinhalten mitochondriale Dysfunktion, oxidativen Stress und Entzündungen2. Die Ursachen und Risikofaktoren für die Krankheit werden noch erforscht, beinhalten aber eine Kombination aus Umwelt- und genetischen Faktoren1. Zum Beispiel haben Studien positive Assoziationen zwischen lebenslangem Pestizideinsatz und PD sowie genetischer Anfälligkeit für familiäre PD1,3gefunden.
Das Modellsystem C. elegans, das ursprünglich zum Teil für die neurobiologische Forschung4entwickelt wurde, eignet sich gut zur Beurteilung des dopaminergen Neuronenverlustes in vivo. Nass und Kollegen leisteten Pionierarbeit bei der Verwendung von C. elegans zur dopaminergen Neurodegeneration5,und viele Gruppen haben seitdem den Wurm als erfolgreiches Modell für PD und dopaminerge Dysfunktion6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 übernommen ,18,19,20. C. elegans sind gute neurodegenerative Krankheitsmodelle aus vielen der gleichen Gründe, aus denen sie ein so beliebter Modellorganismus für andere Bereiche der Biologie sind; Ihre Transparenz ermöglicht die In-vivo-Untersuchung zellulärer Prozesse, die genetische Manipulation bei Würmern ist relativ schnell und einfach, sie haben eine kurze Generationszeit von etwa drei Tagen und sie sind leicht zu pflegen21. Die meisten PD-Wurmmodelle fallen in eine von drei Kategorien: altersbasierte Modelle, chemische Modelle und genetische Modelle. Die Fähigkeit, eine Population von Würmern zu synchronisieren, ermöglicht die Untersuchung der altersbedingten Neurodegeneration für ein altersbasiertes Modell neurodegenerativer Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Altern, wie PD22. Chemische Expositionen, die PD-ähnliche neuronale Defekte induzieren, wurden mit einer Vielzahl von Chemikalien wie 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), Rotenon und 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)22nachgewiesen. Würmer werden auch erfolgreich als genetische Modelle von PD verwendet; Stämme mit ausgewählten neuronalen Gen-Knockouts können verschiedene neurodegenerative Erkrankungenmodellieren 1,4. Kombinationen von genetischen und Umweltfaktoren oder “Gen-Umwelt-Interaktionen”, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei PD2,17,23,24,25,26,27,28spielen , wurden von mehreren Gruppen mit C. elegansuntersucht . Schließlich wurde auch eine altersbedingte dopaminerge Neurodegeneration beobachtet29,30. Wenn ein geeigneter neuronaler transgener Stamm in der fluoreszierenden Bildgebung verwendet wird, kann eines dieser PD-Wurmmodelle verwendet werden, um dopaminerge Neurodegeneration zu untersuchen.
Die Quantifizierung von Veränderungen der neuronalen Morphologie ist ein kritischer Bestandteil der neurodegenerativen Forschung. Bei C. eleganswurden viele fluoreszierende Reporterstämme verwendet, um morphologische Veränderungen und den Verlust von Neuronen sichtbar zu machen. Stämme, die für die neuronale Bildgebung geeignet sind, weisen ein fluoreszierendes Protein auf, das mit zellspezifischen Promotoren assoziiert ist. Für dopaminerge Neurodegenerationstests hat unser Labor den Stamm BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] verwendet, der im dat-1-Gen ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) aufweist, das in den dopaminergen Neuronen exprimiert wird. Beachten Sie, dass der Rollenphänotyp des BY200 eine sehr geringe Penetranz auf hat und selten beobachtet wird. Andere häufige Stämme, die für diese Art der Bildgebung verwendet werden, sind BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]] und einige andere, die vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder auf Anfrage von spezifischen Laborserhältlich sind 1,21,22,29 . Diese Stämme ermöglichen typischerweise die Visualisierung aller drei Klassen dopaminerger Neuronen: cephalische (CEP), vordere deiridische (ADE) und postdeiride (PDE) Neuronen. C. elegans exprimiert das Alpha-Synuclein-Protein nicht auf natürliche Weise, aber Stämme wie BY273 wurden entwickelt, um es zu exprimieren. Wir stellen jedoch fest, dass das von uns präsentierte Scoring-System mit BY200 entwickelt wurde, das kein Alpha-Synuclein exprimiert und vor der Verwendung mit diesem Stamm (oder einem anderen neuen Stamm) validiert werden müsste. Zusätzliche dopaminerge Neuronen sind bei Männern vorhanden, werden aber selten in Betracht gezogen, da Männer normalerweise <1% einer C. elegans-Population ausmachen. Hier konzentrieren wir uns auf die vier dopaminergen CEP-Neuronen, die in der Kopfregion von C. elegansgefunden werden. Dieser Satz von Neuronen ist unter Fluoreszenzmikroskopie leicht zu finden, ist sowohl in Hermaphroditen als auch in männlichen Würmern vorhanden, überschneidet sich typischerweise nicht mit anderen Bereichen der Autofluoreszenz und wird häufig in Wurmstudien berichtet. Obwohl diese Neuronen nicht myeliniert sind, sind die CEP-Dorsal-Neuronen (CEPD) direkt der pseudokoelomischen Körperflüssigkeit ausgesetzt, wo die ventralen CEP-Neuronen nicht. Ein gesunder Satz von CEP-Dendriten wird typischerweise als relativ gerade, ununterbrochene Linien angezeigt. Degenerierte Dendriten können eine beliebige Kombination von Unregelmäßigkeiten und Anzeichen von Schäden aufweisen, einschließlich ausgeprägter Punkte, die als Blebs entlang der Linie des Dendriten bezeichnet werden, und Brüchen in der Linie des Dendriten. Beispiele für CEP-Neuronen mit unterschiedlichen Degenerationsgraden sind in Abbildung 1 zu sehen.
Obwohl die dopaminerge Neurodegeneration von einer wachsenden Anzahl von C. elegans-Labors untersucht wird, gab es eine große Variation in den analytischen Methoden zur Quantifizierung dopaminerger Neuronenschäden29,31,32,33,34. Viele veröffentlichte Studien haben über das Vorhandensein oder Fehlen von CEP-Soma mit einem binären Scoring-System von degenerativen versus typischen oder Wildtyp-Neuronenberichtet 31,32. Diese Scoring-Methoden können bestimmte Stressoren identifizieren, die Neurodegeneration induzieren, aber nicht die Details des Fortschreitens subtilerer neuronaler Schäden quantifizieren oder Leichtunterschiede zwischen Neurodegeneration erkennen, wie sie durch einzigartige Chemikalien oder andere Variablen induziert werden. Darüber hinaus sind Scoring-Systeme, die sich auf die Zellkörper konzentrieren, möglicherweise nicht empfindlich gegenüber weniger schweren Schäden oder neuronalen Schäden, die nur einen Teil der Zelle betreffen, wie z. B. den Dendriten. Da der Dendrit die größte Bandbreite an konsistent nachweisbaren morphologischen Veränderungen als Reaktion auf chemische Stressoren zu haben scheint, haben wir sie als Grundlage für unsere Analyse ausgewählt. Das Scoring-System, das wir hier vorstellen, ist modifiziert von Dendriten-Morphologie-basierten Mehrpunktskalen, die zuvor in unserem Labor29,33verwendet wurden. Dieses System erweitert diese Fünf- und Sechs-Punkte-Skalen zu einer Sieben-Punkte-Skala, um altersbedingte morphologische Veränderungen wie höhere erwartete Knickzahlen bei älteren erwachsenen Dendriten zu berücksichtigen und zwischen schweren Schäden und vollständigem Dendritenverlust zu unterscheiden. Der Zweck der Einführung dieses Scoring-Systems besteht darin, ein umfassendes Bild der Neurodegeneration auf allen Ebenen neuronaler Schäden zu erfassen und ein universelles System zur Unterstützung der Konsistenz in der dopaminergen Neurodegenerationsforschung von C. elegan bereitzustellen. Da die Bewertung von Natur aus subjektiv ist, ist es wichtig, die Konsistenz zwischen den Einzelnen zu maximieren und den Scorer mit manueller Verblindung oder einem automatischen Blendungsprogramm für die Identität der Bilder zu blind machen35. Um die Konsistenz zu verbessern, präsentieren wir eine Reihe von Trainingsbildern und nutzen die Videofunktionen von JoVE, um unser Scoring-System im Detail zu demonstrieren. Wir empfehlen die Verwendung eines Systems, das sowohl ein automatisiertes verblindetes Scoring ermöglicht als auch es dem Scorer ermöglicht, seine Scoring-Konsistenz durch Neubewertung einer Teilmenge von Bildern zu quantifizieren. Dies ist besonders wichtig, wenn Sie Daten von mehreren Wissenschaftlern kombinieren oder vergleichen oder Wissenschaftler ausbilden, die neu im Scoring sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zeigt, wie die in unserem Labor entwickelte Sieben-Punkte-Skala verwendet werden kann, um die morphologische Veränderung und Degeneration dopaminerger Neuronen bei C. eleganszu quantifizieren. Wir haben diese Skala als Werkzeug zur Standardisierung der Analyse der dopaminergen Neurodegenerationsarbeit in Würmern erstellt und geteilt. In Anerkennung der Bedeutung der Untersuchung von Signalwegen, die an weit verbreiteten neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, nutzen viele Forscher die Eignung des C. elegans-Modells für die Visualisierung der Neurobiologie, um die Neurodegeneration29,31,32,33zu untersuchen . Es gibt jedoch noch keine Bemühungen, die große Variation in der Art und Weise, wie Neuronenschäden in der Neurodegenerationsforschung in Würmern quantifiziert werden, zu reduzieren. Das hier vorgestellte Scoring-System soll somit die Konsistenz der Analysen fördern und einen Vergleich zwischen Studien ermöglichen.
Unser Scoring-System kann verwendet werden, um Daten aus C. elegans-Experimenten zu analysieren, die zellspezifische fluoreszierende Reporter verwenden, die die Visualisierung dopaminerger Neuronen – insbesondere der CEP-Dendriten – ermöglichen. Insbesondere Stämme, die am dat-1-Gen für die GFP-Visualisierung der dopaminergen Neuronen markiert sind, sind mit diesem Scoring-Protokoll kompatibel, obwohl viele andere verwandte transgene Modelle von PD existieren. Es ist möglich, dass dieses Bewertungssystem auch bei diesen Modellen nützlich wäre; Dies sollte jedoch vor der Verwendung validiert werden. Insbesondere ist es möglich (aber nach unserem Wissen nicht getestet), dass Stämme mit mCherry für dieses Protokoll nicht gut geeignet sind, da die mCherry-Aggregation möglicherweise nicht von Blasen zu unterscheiden ist oder zu Zellstress führt. Anstatt einen Kommentar zu allen spezifischen Modellen der Parkinson-Erkrankung und verwandter neurodegenerativer Erkrankungen abzugeben, konzentrieren wir uns auf die Bewertung von Neurodegenerationsdaten selbst. Darüber hinaus konzentriert sich dieses Protokoll nur auf die neuronale Morphologie und berücksichtigt nicht die Fluoreszenzspiegel des Somas. Neurodegenerationstests können zusammen mit Verhaltenstests durchgeführt werden, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind, wie z. B. Fortbewegungs-, Lebensdauer- und Gesundheitsexperimente. Der Grad der Degeneration in etablierten chemischen, altersbasierten und genetischen Modellen der Parkinson-Kopplung kann mit diesem Scoring-System ebenfalls bestätigt und detailliert beschrieben werden. Die Messung von Modellen, Mitwirkenden und Signalwegen, die mit Parkinson und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden sind, kann das wissenschaftliche Wissen über diese Erkrankungen erweitern und darauf hinweisen, wie die wachsende Population betroffener Personen bewältigt werden kann. Vergleichbare Neurodegenerationsergebnisse in der Literatur sind der Schlüssel zur Unterstützung dieses Ziels.
Um die aus diesem Scoring-System abgeleiteten Ergebnisse zu interpretieren, schlagen wir vor, jeden Dendriten als n = 1 zu betrachten, da verschiedene Neuronen innerhalb desselben Wurms oft unterschiedlich auf die Behandlung reagieren. Dies kann durch die Tatsache verursacht werden, dass nur die CEPD-Neuronen direkt der pseudokoelomischen Körperflüssigkeit ausgesetzt sind. Auf diese Weise kann die Score-Verteilung der experimentellen Gruppen als Anteil an der Gesamtzahl der in jeder Gruppe erzielten Dendriten angezeigt werden. Diese Methode, die für die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, ermöglicht einen einfachen Vergleich zwischen Behandlungsgruppen, berücksichtigt differentielle Reaktionen innerhalb desselben Wurms und kann leicht mit einem Chi-Quadrat-Test analysiert werden, der durch eine Bonferroni-Korrektur für mehrere Vergleiche ergänzt wird. Eine Beispielvorlage für die Aufzeichnung von Neuronenwerten und die Berechnung von Prozentsätzen finden Sie in Ergänzungsdatei 2. Wir haben zwei alternative Methoden zur Datenanalyse in Betracht gezogen und schwachstellen in jeder identifiziert. Die erste Option besteht darin, die Werte der vier CEP-Neuronen für jeden Wurm zu mittelen. Dadurch werden die Daten parametriert. Es geht jedoch von einer linearen Beziehung mit steigender Punktzahl aus und verliert Informationen über Variationen in der Reaktion auf die Behandlung innerhalb desselben Wurms. Die zweite Möglichkeit besteht darin, die Werte aller vier CEP-Neuronen für jeden Wurm zu summieren, wodurch die Daten ebenfalls parametrifiziert werden. Dies setzt immer noch eine lineare Beziehung zwischen den Scores voraus, berücksichtigt jedoch besser Die Unterschiede innerhalb jedes Wurms als die gemittelten Scores, indem die Parameter möglicher Scores erweitert werden. Wie auch immer sich einzelne Forscher entscheiden, ihre Daten anzuzeigen, die Ergebnisse sollten neben experimentellen Variablen wie Stamm und Wurmalter berücksichtigt werden; Zum Beispiel haben ältere Würmer ein höheres erwartetes Ausgangsniveau der Degeneration.
Da diese Neurodegenerations-Score-Ergebnisse interpretiert werden, sollten sich die Forscher auch einiger Vorbehalte und Einschränkungen der Scoring-Methode bewusst sein. Erstens sind bestimmte technologische Anforderungen erforderlich, um Bilder zu erfassen, die für die Bewertung geeignet sind. Das Bildmikroskop muss Fluoreszenzkanäle sowie Vergrößerungs- und Belichtungseinstellungen unterstützen, die eine klare Visualisierung von CEP-Dendriten ermöglichen. Wie im Protokoll erwähnt, können technologische Anforderungen durch Protokollanpassungen wie das Bewerten von Live-Bildern durch das mikroskopische Feld reduziert werden, anstatt Bilder zu erfassen, die zu einem späteren Zeitpunkt archiviert und bewertet werden sollen. Zweitens sind mögliche statistische Analysemethoden für diese Daten begrenzt, da die Daten nicht parametrisch sind. Die Bewertungsskala wird als progressiv angenommen, kann aber nicht als numerisch betrachtet werden, da es diskrete Score-Optionen gibt und Score-Erhöhungen in Bezug auf die biologische Funktion nicht unbedingt proportional zueinander sind. Aus diesen Gründen sind Chi-Quadrat-Tests für die Unabhängigkeit für diese Art von Daten am besten geeignet, was bedeutet, dass die statistische Analyse vom Beobachter abhängt, um die Richtung einer statistischen Signifikanz zu bestimmen. Bemerkenswerterweise analysiert der Chi-Quadrat-Test auch nur auf Unterschiede in der Score-Verteilung und ist nicht in der Lage, Unterschiede in bestimmten Scoring-Kategorien nachzuweisen. Schließlich muss die funktionelle Bedeutung der morphologischen Veränderungen, die durch dieses Scoring-System quantifiziert werden, noch untersucht werden.
Die zukünftigen Richtungen, die durch die Entwicklung dieses Scoring-Systems ausgelöst werden, beinhalten die Bestimmung biologischer Basen und Korrelationen mit einzelnen Neuronen-Scores. Die Untersuchung der funktionellen Signifikanz (z. B. neuronale Signalgebung, Wurmverhalten) aller Punkte auf der Scoring-Skala wird auf informationen darüber informieren, wie die Ergebnisse besser in Schlussfolgerungen übersetzt werden können, die für das Verständnis der Ursachen und Folgen neurodegenerativer Erkrankungen und die Entwicklung von Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten geeignet sind. Zukünftige Forschungen zur Neurodegeneration bei Würmern sollten darauf abzielen, Verbindungen zu anderen Morphologien wie Wurmform und -größe zu entdecken. Darüber hinaus kann die Neurodegenerationsforschung durch die Untersuchung anderer C. elegans-Stämme unterstützt werden, um Endpunkte wie Bioenergetik, reaktive Sauerstoffspeziesproduktion und mitochondriale Morphologie zu messen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ian T. Ryde für seine Beiträge zur Entwicklung der Scoring-Skala und für seine Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health unterstützt (T32ES021432 unterstützte KSM und P42ES010356 zu JNM).
Materials
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3×1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
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