잎 전송의 변화를 사용하여 아라비도시스 탈리아나의 엽록래스트 운동을 조사합니다.

빛은 광합성, 식물 성장 및 개발에 필수적입니다. 그것은 빛 강도뿐만 아니라 계절이나 하루의 과정을 통해 변경으로 가장 역동적 인 abiotic 요인 중 하나입니다, 뿐만 아니라 신속하고 예측할 수없는 방법으로 구름 커버에 따라. 잎 수준에서, 빛 강도는 또한 주변 식물과 식물의 자신의 캐노피의 밀도와 자연에 의해 영향을받습니다. 식물이 가변 조명 조건에서 빛 차단을 최적화할 수 있는 한 가지 중요한 메커니즘은 청색광 자극^1,2에 대응하여 엽록소가 이동하는 기능입니다. 저조도 조건에서 엽록소는 빛 차단을 극대화하고 광합성을 극대화하기 위해 소위 축적 반응에서 빛(periclinal 세포벽을 따라)에 수직으로 퍼져 나아집니다. 높은 조명 조건에서 엽록소는 소위 회피 반응에서 항클럼세포 벽을 향해 이동하여 광 차단및 광억제의 위험을 최소화합니다. 많은 종에서 엽록소는 또한 축적 및 회피 위치와 종종 ^{그 두 3,4} 사이의 중개와 구별되는 특정 어두운 위치를 가정합니다. 다양한 연구는 엽록소 ^{운동이 잎의} 단기 스트레스 허용 오차뿐만 아니라, 특히 가변 광 조건하에서 식물의 성장과 생식 성공에 중요하다는 것을 입증^{했습니다8,9}.

엽록체 운동은 가벼운 현미경1을 사용하여 특정 살아있는 표본(예를 들어, 조류 또는 엘로데아와 같은 얇은 잎이 많은 식물)에서 실시간으로 쉽게 관찰^됩니다. 그러나 대부분의 잎에서 엽록체 운동을 연구하려면 경현미경¹⁰하에서 시료를 보기 전에 엽록체 이동, 화학적 고정 및 단면 의 준비를 유도하기 위한 전치료가 필요합니다. 공초점 레이저 현미경 검사법의 도입으로, 또한 그대로 또는 고정 된 잎^4,11,12에서 엽록소의 3D 배열을 이미지할 수 있게되었다. 이러한 이미징 기술은 중요한 질적 정보를 제공함으로써 엽록소 운동의 이해를 크게 돕습니다. 엽록소 위치(예를 들어, 이러한 이미지의 백리클 또는 항클린 위치에서 엽록체의 백분율 또는 총 셀 표면당 엽록래가 적용되는 영역의 백분율)을 정량화하는 것도 가능하지만, 특히 위치 ^10,8의 급격한 변화를 포착하는 데 필요한 간격으로 실시되는 경우 매우 시간이 많이 소요됩니다. . 특정 종이나 돌연변이의 어두운 적응된 잎이 회피 반응으로 엽록체 운동을 할 수 있는지 여부를 보여주는 가장 간단한 방법은 잎의 스트립을 높은 빛에 노출시키면서 어둠 속에서 엽록을 유지하기 위해 잎의 대부분의 영역을 덮는 것입니다. 최소 20분 동안 높은 광노출 후 노출된 부위의 엽록소가 회피 위치로 이동하게 되며, 노출된 스트립은 잎의 나머지 부분보다 눈에 띄게 밝은 색상으로 움직입니다. 이것은 야생 유형 A. 탈리아나에 대 한 사실 하지만 엽록체 운동 돌연변이의 일부에 대 한 나중에 더 자세히 설명 ¹³. 이 방법 및 수정(예: 리프의 어떤 부분이 노출되는 반전, 빛의 강도 변화)은 많은 수의 돌연변이를 선별하고 회피 또는 축적 응답 또는 둘 다를 나타낼 능력이 부족한 null 돌연변이를 식별하는 데 유용합니다. 그러나 엽록류 운동의 동적 변화에 대한 정보는 제공하지 않습니다.

대조적으로, 여기서 설명된 방법은 전체 엽록체 운동을 위한 프록시로서 잎을 통한 광 전달의 변화를 사용하여 온전한 잎에서 엽록소 운동의 정량화를 허용합니다: 엽록소가 축적 반응에서 메소필 세포에 퍼지는 조건하에서, 많은 엽록세포가 회피 반응에 있을 때보다 잎을 통해 전달되는 빛이 적다. 항클inal 세포벽을 따라 자신을 배치. 따라서, 전송의 변화는 잎¹⁴에서 전체 엽록소 운동의 대리자로 사용될 수 있다. 기기의 세부 사항은 다른 곳에서 설명되어 있지만 기본적으로 계측기는 청색광을 사용하여 엽록체 이동을 트리거하고 설정된 간격으로 해당 잎을 통해 전송되는 적색 광의 양을 측정합니다. 최근에는 수정된 96웰 마이크로플레이트 판독기, 파란색 LED, 컴퓨터 및 온도 제어 인큐베이터¹⁵를 사용하는 이 시스템의 수정이 설명되었습니다.

스크리닝을 위한 잎의 광학 평가를 포함한 방법의 조합을 사용하는 옵션, 전송의 동적 변화 측정 및 현미경 검사법의 사용에 이어, 클로로플라스트 운동의 생리적/생태적 중요성에 대한 우리의 이해를 크게 지원했습니다. 예를 들어, 그것은 그들의 운동의 특정 양상에서 손상되는 각종 돌연변이의 발견 그리고 특성으로 이끌어 냈습니다. 예를 들어, A. 탈리아나 phot 1 돌연변이체는 저조도에서 엽록체를 축적할 수 있는 능력이 부족하고, phot 2 돌연변이체는 회피 반응을 수행할 수 있는 능력이 부족합니다. 이러한 표현형은 각각 2개의 청색광 수용체^16,17,18의 손상 때문입니다. 대조적으로, chup1 돌연변이는 셀^11,19 내의 원하는 위치로 엽록을 이동하는 데 필수적인 엽록체 주위에 적절한 액틴 필라멘트를 형성하는 능력이 부족합니다. 돌연변이 연구 이외에, 연구원은 프로세스의 기계론적 측면을 해명하기 위하여 엽록체 운동에 각종 억제제의 효력을 평가했습니다. 예를 들어, _H2O2 및 각종 항산화제와 같은 화학 물질은 엽록소류 운동에 대한 이 신호 분자의 효과를 조사하기 위해 사용되었다²⁰. 다양한 억제제는 엽록소 운동²¹에서 칼슘의 역할을 해명하기 위해 사용되었다. 엽록체 운동의 메커니즘을 밝히는 데 도움이 되는 것 외에도, 이러한 방법은 이러한 행동의 생태학적 및 진화적 맥락을 이해하기 위해 다양한 종 이나 돌연변이체에서 엽록체 운동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 엽록소 운동 경로에서 다양한 돌연변이의 영향의 정도가 성장 조건에 의존하는 것으로 나타났다^7,9, 태양 적응 식물은 그들의 엽록성형을 많이 이동하지 않는 것 같다. 대조적으로, 움직임은 그늘 식물에 매우 중요하다10,22,23.

모델 플랜트 A. thaliana에 초점을 맞춘 이 메서드 종이는 이전에 개발된 계측기⁹의 업데이트된 버전인 전송 장치를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 악기는 시판되지 않지만 전자 공학또는 물리학 동료와 학생들의 도움을 기본적인 이해가있는 사람들은 저렴한 부품을 사용하여 자세한 지침을 따르고 장비를 제작 할 수 있습니다 ( 보충 파일 참조). 악기를 구축하는 데 사용되는 오픈 소스 플랫폼은 광범위한 웹 지원과 문제가 발생하면 도움을 제공하는 커뮤니티 포럼^{이 있습니다24}.

이 프로토콜은 다양한 광 조건에 잎을 노출하고 A. thaliana의 어둡고 축적 및 회피 반응을 포착하는 표준 탐색 실행에서 잎 전송의 변화를 결정하는 데 장비를 사용하는 방법에 중점을 둡니다. 이러한 실행은 실험의 목표에 따라 수정할 수 있으며 대부분의 식물 종과 함께 사용할 수 있습니다. 이 논문은 A. 탈리아나 야생형 및 여러 돌연변이의 전송 데이터의 예를 제공하고 데이터를 추가로 분석하는 방법을 보여줍니다.