Adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3)

Il tessuto umano è stato ricevuto dalla resezione del colon o dalle biopsie dell’ileo dall’Ospedale Universitario di Heidelberg per il seguente protocollo. Questo studio è stato condotto sotto le raccomandazioni dell’Ospedale Universitario di Heidelberg con il consenso scritto informato di tutti i soggetti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i campioni sono stati ricevuti e mantenuti in modo anonimo. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica dell’ospedale universitario di Heidelberg ai sensi del protocollo S-443/2017. 1. Mantenimento e passaggio degli organoidi intestinali e del colon ATTENZIONE: Gli organoidi intestinali umani sono derivati da tessuto umano o da cellule staminali pluripotenti/embrionali indotte e, come tali, è richiesta l’approvazione etica. È necessario seguire le normative specifiche per paese. Il materiale umano non è generalmente testato ed è quindi spesso considerato materiale BSL-2. Adeguate condizioni di contenimento devono essere confermate nel paese in cui si svolge l’esperimento. Preparare organoidi intestinali e del colon da tessuti isolati e/o biopsie utilizzando i metodi precedentemente descritti2. Inoltre, maggiori dettagli tecnici su come preparare gli organoidi da materiale derivato dal paziente o da iPSC possono essere trovati in Lees et al. e Mahe et al.24,25. Una volta stabilite le colture organoidi, seguire la routine di scissione descritta di seguito per preparare gli organoidi a eseguire infezioni con patogeni enterici. Seminare 20-100 organoidi in 50 μL di soluzione ECM al 100% in piastre trattate con colture non tissutali a 24 pozzetti. Aggiungere 500 μL di substrati di crescita (Tabella 1) per pozzo. Cambiare il supporto ogni 2 giorni rimuovendo 250 μL del vecchio supporto e aggiungendo 250 μL del mezzo di crescita fresco a ciascun pozzetto. Riscaldare il supporto a temperatura ambiente prima di cambiare il supporto.ATTENZIONE: I fluidi freddi liquefanno la soluzione di ECM contenente organoidi. Passare gli organoidi una volta alla settimana quando l’interno inizia a diventare buio a causa dell’accumulo di cellule morte. Un esempio di questo può essere trovato nella Figura 2. Il giorno della scissione, rimuovere la soluzione di ECM da -20 °C e scongelare sul ghiaccio. Posizionare la nuova piastra di coltura cellulare vuota che verrà utilizzata per seminare gli organoidi dopo la scissione a 37 °C (questo richiede un minimo di 1 ora per essere caldo e potrebbe essere riscaldato durante la notte). Riscaldare i terreni di coltura a temperatura ambiente. Rimuovere il mezzo di crescita con una pipetta P1000 e aggiungere 500 μL di soluzione salina fredda tamponata con 1x fosfato (PBS) a ciascun pozzetto per 3 minuti per liquefare parzialmente la soluzione ECM e dissociarsi dalla piastra. Per garantire la completa interruzione della soluzione ECM, utilizzare una pipetta P1000 (set-up a 450 μL). Pipettare su e giù 10 volte per risospese il PBS, la soluzione ECM e gli organoidi, trasferire gli organoidi risospesi in un tubo conico da 15 ml e metterli sul ghiaccio. Raccogliere più pozzetti degli stessi organoidi nello stesso tubo conico. Se più organoidi diversi (donatori diversi, sezioni diverse, pre-trattamento diversi, ecc.) vengono divisi contemporaneamente, raccoglierli in tubi conici diversi. Durante la raccolta, mantenere i tubi conici sul ghiaccio. Girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con attenzione il PBS con una pipetta per mantenere il pellet organoide sul fondo. Evitare l’utilizzo di un sistema di scarico sottovuoto con una pipetta montata poiché il pellet di organoidi è molto sciolto e può essere facilmente aspirato quando si rimuove il PBS troppo rapidamente. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% al tubo conico e risospesciare gli organoidi pipettando su e giù 10 volte con una pipetta P1000. Incubare il tubo conico contenente organoidi a 37 °C per 3 min. Aggiungere 2 ml di dmEM/F12 media contenenti il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l’1% di penicillina/streptomicina per fermare la digestione e risospesire per interrompere gli organoidi tubando su e giù 10 volte con una pipetta P1000. Girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere i tubi conici dalla centrifuga e conservarli sul ghiaccio. Rimuovere con attenzione il fluido / tripsina con una pipetta monouso da 5 ml per mantenere il pellet organoide sul fondo. Lasciare circa 500 μL di materiale e rimuoverlo con una pipetta P1000. Una volta che il fluido/tripsina è stato rimosso da tutti i tubi conici, rimuovere la piastra trattata con 24 pozzetti non in coltura cellulare dall’incubatore a 37 °C e posizionarla sotto il cofano della coltura cellulare. Aggiungere la soluzione di ECM al 100% (mantenuta sul ghiaccio) al tubo conico con gli organoidi divisi in rapporto da 1:3 a 1:5 a seconda delle abitudini di crescita dei singoli organoidi donatori. (Ad esempio, se un pozzo contenente 20-100 organoidi in una goccia di 50 μL di soluzione di ECM è stato passato, risospesere il pellet organoide in 150-250 μL di soluzione ECM ghiacciata.) Seme 50 μL di soluzione ECM/miscela organoide per pozzetto della piastra trattata con coltura non cellulare a 24 pozzetti preriscaldata a 37 °C.NOTA: la soluzione ECM polimerizzerà molto rapidamente una volta riscaldata. Mantenere la soluzione ECM fredda in ogni momento (conservata su ghiaccio) durante l’uso. Quando gli organoidi sono stati risospesi, seminare immediatamente su un nuovo piatto. Per i principianti, si consiglia di conservare una scatola di punte per pipette a -20 °C per consentire un tempo extra per la semina. Incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 °C per 10-15 minuti per consentire alla soluzione ECM di polimerizzare. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 μL di terreno di crescita (Tabella 1)26 a ciascun pozzetto e incubare gli organoidi a 37 °C. Controllare gli organoidi quotidianamente al microscopio. Cambiare il supporto ogni 2 giorni come nel passaggio 1.4. 2. Preparazione di organoidi in due dimensioni (2D) per l’infezione apicale NOTA: Il seguente protocollo descriverà come seminare gli organoidi intestinali come un monostrato di cellule in una piastra di coltura cellulare per infettare le cellule dell’epitelio intestinale dal loro lato apicale. Utilizzare la piastra a 48 pozzetti per gli esperimenti di sequenziamento e il vetrino a camera di vetro a 8 pozzetti per controllare l’infezione utilizzando approcci di immunofluorescenza. Coltivare e mantenere gli organoidi come descritto nel paragrafo 1. Prima di seminare gli organoidi in 2D, rivestire le piastre a 48 pozzetti e lo scivolo della camera di vetro a 8 pozzetti con 200 μL di collagene umano al 2,5% in acqua per pozzo per 1 ora a 37 °C.NOTA: gli organoidi intestinali sono meglio seminati in piastre a 48 pozzetti e in vetrino a 8 pozzetti. L’esperienza ha dimostrato che non infettano bene in piastre da 96 pozzetti. Gli inserti Transwell possono anche essere utilizzati per consentire l’infezione sia apicale che basolaterale in 2D. Se si utilizzano pozzi trans, monitorare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) prima dell’infezione per confermare un monostrato confluente. Normalmente, gli organoidi intestinali hanno una barriera stretta con un TEER di 450-600 Ohm/cm2. Semina 100-150 organoidi in ogni pozzetto di una piastra a 48 pozzetti o per un pozzetto di una slitta a camera di vetro a 8 pozzetti. Per stimare il numero di organoidi, contare il numero di organoidi presenti nella goccia di soluzione di 50 μL di ECM della piastra a 24 pozzetti preparata nella sezione 1. In media, sono necessari 1-2 pozzi, che daranno circa 15.000-30.000 cellule. Per interrompere la soluzione ECM e tripsinizzare gli organoidi, seguire i passaggi 1.8-1.17. Rimuovere il collagene umano dalle piastre a 48 pozzetti e dalla slitta della camera con fondo di vetro a 8 pozzetti. Sospendere il pellet organoide nel tubo conico in 250 μL di terreno di crescita/pozzetto e aggiungere la miscela ai pozzetti rivestiti di collagene. Posizionare la piastra in un’incubatrice a 37 °C.NOTA: quando si eseguono gli esperimenti, vengono confrontate più condizioni (finto vs. infetto +/- trattamento di interesse). Per ridurre al minimo la variabilità tra ogni pozzetto di organoidi seminati 2D, raccogliere il numero totale di organoidi necessari nello stesso tubo conico. La raccolta di organoidi da un massimo di 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti può utilizzare 1 mL di tripsina e 2 ml di mezzi neutralizzanti. Quando si utilizzano 12-24 pozzetti, aumentare questo a 2 ml di tripsina e 4 ml di mezzi neutralizzanti. Dopo 48 ore, rimuovere la piastra dall’incubatore e posizionarla nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 250 μL per pozzetto di mezzi di differenziazione (Tabella 1). Ripetere questa modifica del supporto 48 ore dopo. Dopo 48 ore, confermare la differenziazione (quattro giorni dopo il passaggio ai mezzi di differenziazione) estraendo RNA, producendo cDNA con 250 ng di RNA ed eseguendo qPCR a base verde SYBR utilizzando primer per cellule staminali (OLFM4 e / o SMOC2), cellule calici (MUC2), cellule enteroendocrine (CHGA) e enterociti (SI e / o CYP3A4) (Figura 3).NOTA: Al passaggio dai mezzi di crescita ai mezzi di differenziazione, gli organoidi diminuiranno la loro espressione di marcatori di cellule staminali (OLFM4 e/o SMOC2) e aumenteranno l’espressione dei marcatori delle cellule caliciformi (MUC2), delle cellule enteroendocrine (CHGA) e degli enterociti (SI e/o CYP3A4) mediante qPCR. Preparare un pozzo extra e mantenere con i mezzi di crescita per confrontare il livello di espressione di ciascun marcatore specifico del tipo di cellula in crescita rispetto ai mezzi di differenziazione. Alla conferma della differenziazione, gli organoidi sono pronti per l’infezione apicale. Spostare gli organoidi al livello di contenimento della biosicurezza richiesto per l’agente patogeno di scelta.ATTENZIONE: Fare riferimento alle normative locali dell’istituto e alle procedure operative standard quando si maneggiano agenti patogeni sotto il contenimento BSL-2 o BSL-3. Per infettare gli organoidi intestinali coltivati in 2D dal loro lato apicale, rimuovere i mezzi con una pipetta P1000 e aggiungere l’agente patogeno diluito alla molteplicità di infezione richiesta per l’esperimento nei mezzi di differenziazione (il volume minimo di miscela patogeno/media è di 50 μL per pozzetto e il volume massimo è di 250 μL per pozzetto). Lasciare che l’infezione proceda per 2 ore a 37 °C con un tavolo a bilanciere situato nell’incubatore di colture cellulari o oscillando manualmente la piastra ogni 15-20 minuti. Ottimizza questo tempo in base all’agente patogeno scelto. Dopo 2 ore, rimuovere il supporto con una pipetta P1000 e sostituirlo con 250 μL per pozzetto di mezzi di differenziazione freschi. Incubare le cellule a 37 °C fino al punto temporale del sequenziamento a singola cellula. Per preparare le cellule per il sequenziamento a singola cellula, procedere alla sezione 4. 3. Preparazione di organoidi in tre dimensioni (3D) per l’infezione apicale e basolaterale Coltivare organoidi come descritto nel paragrafo 1 in una piastra trattata con 24 pozzetti non cellulari. Due giorni dopo il passaggio, rimuovere la piastra dall’incubatrice e metterla in una cappa di coltura cellulare. Rimuovere il mezzo di crescita con una pipetta P1000, sostituirlo con 500 μL/pozzetto di mezzi di differenziazione preriscaldati a temperatura ambiente e posizionare la piastra nell’incubatore a 37 °C. Dopo 48 ore, sostituire con mezzi di differenziazione freschi (500 μL/pozzetto).NOTA: Gli organoidi sono mantenuti in mezzi di differenziazione per un totale di 4 giorni prima dell’infezione. Confermare la differenziazione come descritto nel passaggio 2.9. Alla conferma che si è verificata la differenziazione, gli organoidi sono pronti per l’infezione. Scongelare ECM sul ghiaccio. Riscaldare il mezzo di differenziazione a temperatura ambiente e riscaldare una piastra a 24 pozzetti a 37 °C. Per eseguire infezioni, rimuovere gli organoidi dalla soluzione ECM.NOTA: rimuovere quanta più soluzione ECM possibile in quanto i virus preferiscono attenersi alla soluzione ECM piuttosto che alle cellule. Se c’è troppa soluzione di ECM rimanente intorno agli organoidi, l’infettività sarà gravemente influenzata. Interrompere l’ECM aggiungendo 500 μL di PBS freddo 1x e incubando per 3 minuti. Utilizzare un P1000 per pipettare su e giù 10x. Unire gli organoidi in un tubo e centrifugare a 500 x g per 5 min. Rimuovere PBS con un P1000.NOTA: Per ridurre al minimo la variabilità tra ciascuna condizione di infezione, combinare gli organoidi provenienti da diversi pozzetti di una piastra a 24 pozzetti nello stesso tubo conico. Ad esempio, se sono necessarie otto condizioni per l’infezione, otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti (contenente ~ 100 organoidi ciascuno) saranno combinati e successivamente divisi in otto pozzetti di una nuova piastra a 24 pozzetti dopo l’interruzione dell’ago (vedere il passaggio 3.12). Risospese gli organoidi in 1 mL di mezzi di differenziazione. Per l’infezione apicale e basolaterale seguire il passo 3.10.1 e per l’infezione basolaterale seguire solo il passo 3.10.2. Attaccare un ago da 27 G a una siringa da 1 mL e risospesciare il pellet sei volte per consentire l’interruzione degli organoidi e per l’infezione sia sul lato apicale che basolaterale. Procedere al passaggio 3.11.NOTA: Gli organoidi dovrebbero essere i classici organoidi dall’aspetto a cisti e dal polpo con un centro scuro se osservati prima della rottura dell’ago. Dopo l’interruzione, questi organoidi appariranno più piccoli con un interno meno o nessun scuro. Quando si esegue l’infezione, ci saranno sempre un minimo di due condizioni (simulazione e infezione), un minimo di due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti sarà inizialmente combinato in un tubo conico da 15 ml per l’interruzione basata sull’ago (spiegando perché un minimo di 1 mL viene utilizzato per la risospensione). Quando si eseguono più di due condizioni, combinare fino a 10 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti in un singolo tubo conico da 15 ml e risospesiare in 1 mL di mezzo di differenziazione per la rottura dell’ago. Dopo l’interruzione, aggiungere 500 μL di mezzi di differenziazione per n + 1 (ad esempio, se si utilizzano 10 pozzetti, quindi ricaricare con 4,5 ml per avere 5,5 ml totali). Se sono necessarie più di 10 condizioni, utilizzare diversi tubi conici. Si raccomanda una siringa da 1 mL poiché gli organoidi vengono interrotti meglio con questo volume della siringa. Un’alternativa a una siringa consiste nell’impiegare una punta P1000 ben appiattita. Sospendere gli organoidi in 500 μL di mezzi di differenziazione per pozzetto. Fare attenzione a non disturbare gli organoidi e assicurarsi che il lato apicale non sia accessibile. Procedere al passaggio 3.11. Trasferire 500 μL di sospensioni organoidi per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti utilizzando una pipetta P1000 e spostare la piastra al livello di contenimento di biosicurezza richiesto per l’agente patogeno di scelta.ATTENZIONE: Fare riferimento alle normative locali e alle procedure operative standard dell’istituto quando si maneggiano agenti patogeni sotto il contenimento BSL-2 o BSL-3. Eseguire sempre la rottura dell’ago degli organoidi al di fuori del BSL-3 per evitare potenziali incidenti con l’ago. Le normative locali possono anche impedire l’uso di aghi nel BSL-3. Aggiungere l’agente patogeno diluito in mezzi di differenziazione per raggiungere la molteplicità di infezione richiesta per l’esperimento. Non superare un volume totale di 500 μL (per avere 1 mL totale nella piastra a 24 pozzetti). Lasciare che l’infezione proceda per 2 ore (questa volta dovrà essere adattata all’agente patogeno di scelta) a 37 °C con un tavolo a bilanciere situato nell’incubatore di colture cellulari o dondolando manualmente la piastra ogni 15-20 minuti. Dopo l’incubazione di 2 ore, raccogliere gli organoidi in un tubo da 1,5 ml per condizione e ruotare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il mezzo contenente l’agente patogeno con una pipetta P1000 e conservarlo sul ghiaccio. Lavare gli organoidi pellet una volta con PBS. Sospendere gli organoidi in 50 μL di soluzione ECM al 100% (che in precedenza era scongelata su ghiaccio), placcare in una piastra trattata con colture non cellulari a 24 pozzetti preriscaldata a 37 °C e incubare la piastra a 24 pozzetti a 37 °C per 10-15 minuti per consentire alla soluzione ECM di polimerizzare. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 μL di mezzi di differenziazione a temperatura ambiente in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C fino alla raccolta per il sequenziamento monocellulare.NOTA: se la raccolta deve avvenire più di 48 ore dopo la semina, cambiare il supporto ogni 2 giorni rimuovendo il vecchio supporto e sostituendolo con 500 μL di mezzi di differenziazione freschi. Tuttavia, l’esperienza ha dimostrato che, poiché gli organoidi sono coltivati sotto mezzi di differenziazione, non sopravviveranno molto più a lungo di 48 ore. 4. Preparazione della soluzione monocellulare e preparazione delle perle di gel in emulsione (OGM) in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3) NOTA: Il completamento delle seguenti fasi richiede che l’apparecchiatura di sequenziamento a cella singola (Tabella dei materiali) e una macchina PCR in grado di gestire reazioni da 100 μL siano presenti all’interno di un impianto BSL-3. Gli organoidi sono coltivati come descritto nel paragrafo 1 e infettati come descritto nei paragrafi 2-3 a seconda dell’agente patogeno e della via di ingresso. In un momento predeterminato dopo l’infezione, gli organoidi vengono raccolti. Di seguito è descritto il metodo utilizzato per raccogliere gli organoidi intestinali. Prima della raccolta degli organoidi infetti, rimuovere le perle di gel unicellulare(Tabella dei materiali)da -80 °C e riscaldarle a temperatura ambiente (almeno 30 minuti prima). Inoltre, equilibrare il reagente RT, l’agente riducente B e l’enzima RT C (tutti conservati a -20 °C) a temperatura ambiente. Sostituire l’oligo dell’interruttore del modello come descritto nelle istruzioni del produttore.NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere eseguiti in relazione alle normative locali sulla biosicurezza seguendo la procedura operativa standard stabilita per l’agente patogeno considerato. Come regola generale per il lavoro BSL-3, è necessario assicurarsi che l’esterno di tutti i vasi (piastre, tubi, ecc.) che escono da una cappa di coltura cellulare siano adeguatamente disinfettati. Lo stesso vale per le mani/guanti della persona che esegue gli esperimenti. Per eseguire infezioni su organoidi seminati in 2D (sezione 2) procedere al passaggio 4.4. Per eseguire infezioni su organoidi 3D (paragrafo 3) procedere al paragrafo 4.5. Per le infezioni di organoidi 2D, portare la piastra di coltura cellulare nella cappa e rimuovere il mezzo di differenziazione con una pipetta P1000. Aggiungere 250 μL di 1x PBS a temperatura ambiente a ciascun pozzetto. Rimuovere il PBS con una pipetta P1000 e aggiungere 250 μL di enzima di dissociazione a temperatura ambiente (ad esempio, TrypLE Express) a ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Cambiare i guanti, pulire la piastra e posizionare la piastra con l’enzima di dissociazione nell’incubatore a 37 °C. Osservare la dissociazione cellulare al microscopio ogni 5 minuti.NOTA: Approssimativamente, ci vogliono 15 minuti per dissociare gli organoidi intestinali coltivati in 2D in singole cellule. Questo tempo dovrà essere regolato in quanto dipenderà da quanti organoidi sono stati inizialmente seminati e infettati, nonché dall’agente patogeno poiché alcuni agenti patogeni sono più citopatici e causano la dissociazione degli organoidi molto più velocemente di altri. Dopo la conferma di un’apparente sospensione monocellulare, riportare la piastra nella cappa di coltura cellulare e interrompere la digestione aggiungendo 250 μL di mezzo DMEM/F12 contenente il 10% di FBS per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Raccogliere le celle in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta P1000. Cambiare i guanti, pulire il tubo e far girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con attenzione l’enzima media/dissociazione con un P1000 per mantenere il pellet cellulare sul fondo. Risospesere singole celle in un volume minimo di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Per gli organoidi intestinali, sospendere in 250 μL per ogni pozzetto della piastra a 48 pozzetti. Passare le sospensioni cellulari in un tubo FACS con un filtro per rimuovere eventuali grumi di grandi dimensioni e posizionare il tubo FACS contenente cellule sul ghiaccio. Procedere al passaggio 4.6 per continuare con il conteggio delle cellule e la preparazione del mix principale. Per le infezioni di organoidi 3D, rimuovere la piastra dall’incubatore e posizionarla nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere il mezzo di differenziazione da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti con una pipetta P1000. Aggiungere 500 μL di PBS 1x ghiacciato a ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti sul ghiaccio. Per garantire la completa interruzione della soluzione ECM, utilizzare una pipetta P1000 (impostata su 450 μL). Pipetta su e giù 10 volte per risospese la soluzione PBS, ECM e gli organoidi; trasferire gli organoidi risospesi in un tubo conico da 15 ml e metterli su ghiaccio. Raccogliere ogni condizione di infezione nel proprio tubo conico da 15 ml.NOTA: l’uso di un tubo conico da 15 mL fornisce un pellet di cella migliore e più distinto rispetto a un tubo conico da 50 mL o un tubo da 1,5 ml. Cambiare i guanti e rimuovere il tubo dal cappuccio di coltura cellulare. Pulire l’esterno del tubo. Girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Spostare nuovamente il tubo nella cappa di coltura cellulare e rimuovere PBS con una pipetta P1000 per evitare di riutilizzare il pellet di organoidi dal fondo del tubo. Risospendare il pellet in 1 mL di enzima di dissociazione (ad esempio, TrypLE Express). Cambiare i guanti, pulire il tubo e incubare i campioni a 37 °C. Ogni 10 minuti per 30 minuti, spostare il tubo nella cappa di coltura cellulare e risospesciare gli organoidi pipettando su e giù con una pipetta P1000 10 volte.NOTA: Normalmente, gli organoidi intestinali richiedono circa 30 minuti per formare una sospensione monocellulare quando infettati in 3D. Per determinare quando gli organoidi sono dissociati a singole cellule, prelevare 10 μL della sospensione organoide usando una pipetta p10. Posizionare la sospensione in un vetrino monouso per contatori di celle in plastica. Sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente. Cambiare i guanti e pulire l’esterno del contatore cellulare. Utilizzare un microscopio a campo luminoso per determinare se viene prodotta una sospensione a singola cellula. Dopo la conferma di una sospensione a cella singola, interrompere la digestione aggiungendo 1 mL di supporto DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e pipetta su e giù 10 volte con una pipetta P1000. Cambiare i guanti, pulire il tubo e far girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con attenzione l’enzima media/dissociazione con una pipetta P1000 per evitare di risospendere il pellet cellulare dal fondo del tubo. Risospesciare le singole celle in un volume minimo di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Per gli organoidi intestinali si sospende in 250 μL. Passare le sospensioni cellulari in un tubo FACS con un filtro per rimuovere eventuali grumi di grandi dimensioni e posizionare il tubo FACS contenente cellule sul ghiaccio. Procedere al passaggio 4.6 per continuare con il conteggio delle cellule e la preparazione del mix principale. Determinare il numero di cellule per μL aggiungendo 10 μL della sospensione cellulare a una camera di conteggio delle cellule di plastica usa e getta. Sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente prima di rimuovere il campione dalla cappa di coltura cellulare, poiché in questa fase la sospensione cellulare è ancora infettiva. Cambia i guanti, pulisci la camera di conteggio delle cellule e conta il numero di cellule usando un microscopio a campo luminoso. All’interno della cappa di coltura cellulare, preparare un mix principale di reagente RT, Oligo Interruttore modello, Agente riducente B ed enzima RT C in un tubo da 1,5 ml secondo le istruzioni del produttore a seconda del numero di campioni nell’esperimento. Per ogni campione, aliquota 33,4 μL di miscela master in un tubo PCR e conservare su ghiaccio. Aggiungere le celle e l’acqua alla miscela principale in base al numero di cella di destinazione come descritto nelle istruzioni del produttore.NOTA: il 50%-60% delle celle viene normalmente recuperato (ad esempio, quando si caricano 10.000 celle sul chip, vengono utilizzate 5.000-6.000 celle per l’analisi). Pertanto, caricare sempre 10.000 celle. Se la densità cellulare non lo consente, centrifugare le celle e risospenderle in un volume inferiore. Fare attenzione a non sovraccaricare il chip in quanto ciò comporterà l’intasamento del chip. Inoltre, se le cellule non sono adeguatamente dissociate, ci sarà un aumentato rischio di ottenere più cellule per perlina, che dovranno essere rimosse nell’elaborazione bioinformatica a valle. Cambiare i guanti, spostare il controller a cella singola nella cappa di coltura cellulare e preparare il chip poiché il chip è coperto solo da una guarnizione non sigillata.NOTA: la macchina deve essere all’interno del cofano per evitare l’esposizione a sospensioni cellulari infette e potenziali aerosol. Aggiungere il chip a cella singola al portachip e riempire le corsie inutilizzate con il 50% di glicerolo. Aggiungere il mix principale, le perline e l’olio di partizionamento alle corsie utilizzate per i campioni secondo le istruzioni del produttore. Coprire il chip con la guarnizione, caricare il chip nel controller e avviare il programma.NOTA: si consiglia di caricare solo sei delle otto corsie. I problemi con emulsioni improprie si verificano spesso nelle corsie uno e otto. La società afferma che tutte le corsie sono indipendenti e questo non dovrebbe accadere; tuttavia, se possibile, evitare queste due corsie ed eseguire due chip se sono necessari otto campioni. Al termine del programma, rimuovere il chip e la guarnizione. Utilizzare una pipetta multicanale e trasferire 100 μL delle emulsioni in un tubo PCR pulito. Assicurarsi che ogni pozzo abbia un colore bianco uniforme che indichi che si è verificata un’emulsione completa. Cambiare i guanti, pulire i tubi e trasferire il tubo PCR a una macchina PCR in grado di supportare reazioni da 100 μL. Eseguire il programma: 53 °C per 45 min; 85 °C per 5 min. Al termine, conservare i campioni a 4 °C. A questo punto, elaborare la reazione secondo le istruzioni del produttore o conservare a 4 °C per 3 giorni o -20 °C per 1 settimana. Dopo 5 minuti a 85 °C, la maggior parte dei virus avvolti verrà inattivata, rimuoverà il cDNA dal BSL-3 secondo la normale procedura operativa ed eseguirà i preparativi della libreria in un laboratorio BSL-1.NOTA: Questo esperimento deve essere eseguito come tre repliche biologiche (ad esempio, in tre giorni diversi) perché l’entità della differenziazione di ciascun tipo di cellula può variare leggermente tra ogni esperimento. Le librerie di sequenziamento risultanti potrebbero essere indicizzate e sequenziate in modo diverso in un’unica esecuzione di sequenziamento.