在生物安全3级（BSL-3）条件下使胃肠道类器官适应病原体感染和单细胞测序

从海德堡大学医院的结肠切除术或回肠活检中接受人体组织，用于以下方案。这项研究是在海德堡大学医院的建议下进行的，根据《赫尔辛基宣言》，所有受试者都得到了知情的书面同意。所有样本均以匿名方式接收和维护。该协议由海德堡大学医院伦理委员会根据协议S-443 / 2017批准。 1. 肠道和结肠类器官的维持和传代 注意：人类肠道类器官来源于人体组织或诱导多能/胚胎干细胞，因此需要伦理批准。需要遵守特定国家/地区的法规。人体材料通常未经测试，因此通常被认为是BSL-2材料。需要在实验进行国确认适当的收容条件。 使用前面描述的方法2从分离的组织和/或活检中制备肠道和结肠类器官。此外，有关如何从患者来源的材料或iPSCs制备类器官的更多技术细节可以在Lees等人和Mahe等人24，25中找到。 一旦建立了类器官培养，请遵循以下描述的分裂常规，以制备类器官以进行肠道病原体感染。 在24孔非组织培养处理的板中将20-100个类器官接种在50μL100M溶液中。每孔加入500μL生长培养基（表1）。 每2天更换一次培养基，取出250μL旧培养基，向每个孔中加入250μL新鲜培养基。在更换介质之前，将介质加热到室温。注意：冷介质会使含有类器官的 ECM 溶液液化。 当内部由于死细胞的积累而开始变暗时，每周排出一次类器官。这方面的一个例子可以在 图2中找到。 在分裂当天，从-20°C取出ECM溶液并在冰上解冻。 放置新的空细胞培养板，该培养板将在37°C下分裂后用于接种类器官（这需要至少1小时才能变暖并且可以加热过夜）。将培养基加热至室温。 用P1000移液管除去生长培养基，并向每个孔中加入500μL冷1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）3分钟，以部分液化ECM溶液并从板中解离。 为确保完全破坏 ECM 溶液，请使用 P1000 移液器（设置为 450 μL）。上下移液 10 次以重悬 PBS、ECM 溶液和类器官，将重悬的类器官转移到 15 mL 锥形管中，并将它们放在冰上。 将相同类器官的多个孔收集到同一锥形管中。 如果同时分裂多种不同的类器官（不同的供体，不同的切片，不同的预处理等），请将它们收集在不同的锥形管中。收集时，将锥形管保持在冰上。 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 用移液器小心地取出PBS，以保持底部的类器官沉淀。 避免使用带有移液器的真空废物系统，因为类器官的颗粒非常松散，并且在太快去除PBS时很容易被吸入。 向锥形管中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶，并用 P1000 移液器上下移液 10 次，重悬类器官。将含有类器官的锥形管在37°C孵育3分钟。 加入 2 mL 含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基，以停止消化，并通过用 P1000 移液器上下移液 10 次来重悬以破坏类器官。 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 从离心机中取出锥形管并将其储存在冰上。 用5 mL一次性移液管小心地除去培养基/胰蛋白酶，以保持底部的类器官沉淀。留出约500μL培养基，并用P1000移液器将其取出。 一旦从所有锥形管中取出培养基/胰蛋白酶，从37°C培养箱中取出24孔非细胞培养处理的板并将其置于细胞培养罩下。 根据个体供体类器官的生长习性，将100M溶液（保持在冰上）加入锥形管中，以1：3至1：5的比例将分裂的类器官。（例如，如果在50μL滴ECM溶液中通过一个含有20-100个类器官的孔，则将类器官沉淀重悬到150-250μL冰冷的ECM溶液中。 接种50μLECM溶液/类器官混合物每孔24孔非细胞培养处理板，预热至37°C。注意：ECM溶液一旦变暖，就会很快聚合。使用过程中始终保持ECM溶液冷藏（储存在冰上）。当类器官重悬后，立即在新板上播种。对于初学者，建议将一盒移液器吸头存放在-20°C，以留出额外的播种时间。 将24孔板在37°C下孵育10-15分钟，以使ECM溶液聚合。 聚合后，向每个孔中加入500μL生长培养基（表1）26，并在37°C下孵育类器官。 每天通过显微镜检查类器官。每 2 天更换一次介质，如步骤 1.4 所示。 2. 二维（2D）类器官的制备 注意：以下方案将描述如何将肠道类器官作为细胞的单层接种在细胞培养板中，以从其顶端感染肠上皮细胞。使用48孔板进行测序实验，使用8孔玻璃底室载玻片使用免疫荧光方法控制感染。 生长和维持类器官，如第1节所述。 在2D中接种类器官之前，在37°C下用200μL2.5%人胶原蛋白在每孔水中涂覆48孔板和8孔玻璃底载玻片1小时。注意：肠道类器官最好接种在48孔板和8孔玻璃底室载玻片中。经验表明，它们在96孔板中感染不良。Transwell插入片也可用于2D的顶端和基底外侧感染。如果使用透气孔，请在感染前监测经上皮电阻 （TEER） 以确认汇合单层。通常，肠道类器官具有紧密的屏障，TEER为450-600 Ohm / cm2。 在48孔板的每个孔中播种100-150个类器官，或为8孔玻璃底室载玻片的一个孔接种。 为了估计类器官的数量，计算在第1节中制备的24孔板的50μLECM溶液滴中存在的类器官的数量。平均而言，需要1-2个孔，这将产生大约15，000-30，000个细胞。 要破坏ECM溶液并使类器官胰蛋白酶消化，请遵循步骤1.8-1.17。 从48孔板和8孔玻璃底腔载玻片中去除人胶原蛋白。 将类器官沉淀重悬于锥形管中，加入250μL生长培养基/孔中，并将混合物加入胶原包衣孔中。将板置于37°C培养箱中。注意：在进行实验时，比较多种条件（模拟 与 感染的+/-治疗感兴趣）。为了最大限度地减少每个2D种子类器官孔之间的变异性，在同一锥形管中收集必要类器官的总数。从多达 12 孔的 24 孔板中收集类器官，可以使用 1 mL 胰蛋白酶和 2 mL 中和培养基。当使用12-24孔时，将其增加到2mL胰蛋白酶和4mL中和培养基。 48小时后，从培养箱中取出板并将其置于细胞培养罩中。除去生长培养基并用每孔250μL分化培养基代替它（表1）。48 小时后重复此介质更换操作。 48小时后，通过提取RNA，用250ng RNA制作cDNA，并使用干细胞（OLFM4和/或SMOC2），杯状细胞（MUC2），肠内分泌细胞（CHGA）和肠细胞（SI和/或CYP3A4）的引物进行SYBR绿色qPCR来确认分化（切换到分化培养基后四天）（图3）。注意：从生长培养基切换到分化培养基后，类器官会降低干细胞标志物（OLFM4和/或SMOC2）的表达，并通过qPCR增加杯状细胞（MUC2），肠内分泌细胞（CHGA）和肠细胞（SI和/或CYP3A4）标记物的表达。准备额外的孔并用生长培养基维持，以比较生长培养基中每个细胞类型特异性标记物的表达水平 与 分化培养基。 在确认分化后，类器官已准备好进行顶端感染。将类器官移动到所选病原体所需的生物安全水平收容。注意：在BSL-2或BSL-3遏制下处理病原体时，请参阅研究所的当地法规和标准操作程序。 为了从其顶端感染2D生长的肠道类器官，用P1000移液管除去培养基，并在分化培养基中加入以实验所需的感染多重性稀释的病原体（病原体/培养基混合物的最小体积为每孔50μL，最大体积为每孔250μL）。 允许感染在37°C下进行2小时，使用位于细胞培养箱中的摇臂台或每15-20分钟手动摇动板。根据所选的病原体优化此时间。 2小时后，用P1000移液器取出培养基，并用每孔250μL新鲜分化培养基替换。将细胞在37°C孵育至单细胞测序的时间点。 要制备用于单细胞测序的细胞，请继续执行第4部分。 3. 制备用于顶端和基底外侧感染的三维（3D）类器官 如第1节所述，在24孔，非细胞培养处理的平板中生长类器官。 传代后两天，从培养箱中取出板并放入细胞培养罩中。 用P1000移液器除去生长培养基，用预热至室温的500μL/孔分化培养基代替，并将板置于37°C培养箱中。 48小时后，用新鲜的分化培养基（500μL/孔）代替。注意：在感染前，类器官在分化培养基中维持总共4天。 确认步骤 2.9 中所述的区分。 在确认已发生分化后，类器官已准备好接受感染。 在冰上解冻ECM。将分化培养基加热至室温，并在37°C下加热24孔板。 要进行感染，请从ECM溶液中取出类器官。注意：尽可能多地去除 ECM 溶液，因为病毒更喜欢粘附在 ECM 溶液而不是细胞上。如果类器官周围残留的ECM溶液过多，则感染性将受到严重影响。 通过加入500μL冷1x PBS并孵育3分钟来破坏ECM。使用 P1000 上下移液 10 倍。将类器官混合在管中，以500×g离心5分钟。使用 P1000 卸下 PBS。注意：为了最大限度地减少每种感染条件之间的差异，将来自24孔板的几个孔的类器官组合到同一个锥形管中。例如，如果需要八个感染条件，则24孔板（每个包含约100个类器官）的八个孔将被合并，随后在针头破坏后分成新的24孔板的八个孔（见步骤3.12）。 将类器官重悬于 1 mL 分化培养基中。对于根尖和基底外侧感染，请遵循步骤 3.10.1，对于基底外侧感染，仅遵循步骤 3.10.2。 将27 G针头连接到1 mL注射器上，并将沉淀重悬六次，以允许类器官的破坏并在顶端和基底外侧发生感染。继续执行步骤 3.11。注意：在针头断裂之前观察到时，类器官应该是经典的囊肿外观和章鱼芽状类器官，中心为深色。在破坏之后，这些类器官将显得更小，内部更少甚至没有黑暗。在进行感染时，总是会有至少两种情况（模拟和感染），24孔板的至少两个孔最初将组合成15 mL锥形管以进行基于针头的破坏（解释为什么至少使用1 mL用于重悬）。当进行两个以上的条件时，将多达10个孔的24孔板组合在单个15 mL锥形管中，并重悬于1 mL分化培养基中以进行针头破坏。中断后，每n + 1加入500μL分化培养基（例如，如果使用10孔，则用4.5mL充注以获得5.5 mL总量）。如果需要10个以上的条件，请使用几个锥形管。建议使用1 mL注射器，因为注射器的这个体积会更好地破坏类器官。注射器的替代方法是使用扁平的P1000尖端。 将类器官重悬于每孔500μL分化培养基中。注意不要破坏类器官，并确保顶端一侧不可触及。继续执行步骤 3.11。 使用P1000移液器将每孔500μL类器官悬浮液转移到24孔细胞培养板中，并将板移动到所选病原体所需的生物安全水平。注意：在BSL-2或BSL-3遏制下处理病原体时，请参阅当地法规和研究所的标准操作程序。始终对BSL-3外的类器官进行针头破坏，以避免针头发生潜在事故。当地法规也可能阻止在BSL-3中使用针头。 加入在分化培养基中稀释的病原体，以达到实验所需的感染多重性。不要超过500μL的总体积（在24孔板中总共有1mL）。 允许感染在37°C下进行2小时（此时需要适应所选的病原体），使用位于细胞培养箱中的摇床台或每15-20分钟手动摇动板。 在2小时孵育后，将类器官收集到每个条件下的1.5mL管中，并在4°C下以500×g旋转5分钟。 用P1000移液器移出含有病原体的培养基，并将其储存在冰上。用PBS洗涤一次类器官沉淀。 将类器官重悬于50μL的100M溶液（先前在冰上解冻）中，板放入预热至37°C的24孔非细胞培养处理板中，并将24孔板在37°C下孵育10-15分钟，以使ECM溶液聚合。 聚合后，在室温下向每个孔中加入500μL分化培养基，并在37°C下孵育，直到收获以进行单细胞测序。注意：如果接种后需要收获超过48小时，请每2天更换一次培养基，方法是取出旧培养基并用500μL新鲜分化培养基代替。然而，经验表明，由于类器官是在分化培养基下生长的，因此它们的存活时间不会超过48小时。 4. 在生物安全3级（BSL-3）条件下制备单细胞溶液和凝胶微珠（GEMs） 注意：完成以下步骤需要单细胞测序设备（材料表）和能够处理100μL反应的PCR机存在于BSL-3设施内。类器官如第1节所述生长，并按照第2-3节所述感染，具体取决于病原体和进入途径。在感染后预先确定的时间，收获类器官。下面描述了用于收获肠道类器官的方法。 在收获受感染的类器官之前，从-80°C取出单细胞凝胶珠（材料表），并升温至室温（至少提前30分钟）。 此外，将RT试剂，还原剂B和RT酶C（全部储存在-20°C）平衡至室温。重悬模板开关寡核苷酸，如制造商的说明中所述。注：根据所考虑的病原体的既定标准操作程序，需要根据当地生物安全法规执行以下步骤。作为BSL-3工作的经验法则，必须确保对离开细胞培养罩的所有容器（板，管等）的外部进行适当消毒。这同样适用于进行实验的人的手/手套。 要对在2D中播种的类器官进行感染（第2节），请继续执行步骤4.4。要对3D类器官进行感染（第3节），请转到第4.5节。 对于2D类器官感染，将细胞培养板带入罩中，并用P1000移液管除去分化培养基。 向每个孔中加入250μL室温下的1x PBS。 用P1000移液器除去PBS，并向48孔板的每个孔中加入250μL室温解离酶（例如TrypLE Express）。换手套，清洁板，并将带有解离酶的板放入37°C培养箱中。 每5分钟通过显微镜观察细胞解离。注意：大约需要15分钟才能将2D培养的肠道类器官解离成单细胞。这个时间需要调整，因为它将取决于最初播种和感染的类器官数量以及病原体，因为一些病原体更具细胞敏感性，并导致类器官比其他器官更快地解离。 在确认明显的单细胞悬浮液后，将板带回细胞培养罩，并通过在48孔板的每孔中加入250μL含有10S的DMEM / F12培养基来停止消化。 使用P1000移液器将细胞收集到15mL锥形管中。 换手套，清洁试管，并在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 用P1000小心地除去培养基/解离酶，以保持细胞沉淀在底部。将单个细胞重悬于含有0.1%BSA的最小体积PBS中。对于肠道类器官，对于48孔板的每个孔，重悬于250μL中。 将细胞悬浮液通过过滤器进入FACS管中，以除去任何大团块并将含有细胞的FACS管放在冰上。 继续执行步骤4.6，继续细胞计数和预混液的制备。 对于3D类器官的感染，从培养箱中取出板并将其置于细胞培养罩中。 用P1000移液器从24孔板的每个孔中除去分化介质。向每个孔中加入500μL冰冷的1x PBS，并在冰上孵育3分钟。 为确保ECM溶液完全中断，请使用P1000移液器（设置为450μL）。上下移液10次，重悬PBS，ECM溶液和类器官;将重悬的类器官转移到15 mL锥形管中并置于冰上。将每种感染情况收集在其自己的15 mL锥形管中。注意：使用15 mL锥形管比50 mL锥形管或1.5 mL管具有更好，更独特的细胞沉淀。 换上手套，将管子从细胞培养罩中取出。清洁管子的外部。 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 将管子移回细胞培养罩，并用P1000移液器取出PBS，以避免从管底部重悬类器官沉淀。 将沉淀重悬于1mL解离酶（例如，TrypLE Express）中。换手套，清洁试管，并将样品在37°C孵育。 每10分钟持续30分钟，将管子移回细胞培养罩中，并通过用P1000移液器上下移液10次来重悬类器官。注意：通常，肠道类器官在3D感染时需要大约30分钟才能形成单个细胞悬浮液。 为了确定何时将类器官解离到单个细胞，使用p10移液管取10μL类器官悬浮液。 将悬浮液置于一次性塑料细胞计数器载玻片中。用透明胶带密封样品输入端口。 换上手套，清洁细胞计数器的外部。使用明场显微镜确定是否制造了单细胞悬浮液。 确认单细胞悬浮液后，通过加入1mL含有10S的DMEM / F12培养基并用P1000移液器上下移液10次来停止消化。 换手套，清洁试管，并在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 用P1000移液器小心地除去培养基/解离酶，以避免从管底部重用细胞沉淀。 将单个细胞重悬于含有0.1%BSA的最小体积PBS中。对于肠道类器官，重悬于250μL中。 将细胞悬浮液通过过滤器进入FACS管中，以除去任何大团块并将含有细胞的FACS管放在冰上。 继续执行步骤4.6，继续细胞计数和预混液的制备。 通过将10μL细胞悬浮液加入一次性塑料细胞计数室来确定每μL的细胞数。 在从细胞培养罩中取出样品之前，用透明胶带密封样品输入端口，因为在此阶段，细胞悬浮液仍然具有传染性。 换手套，清洁细胞计数室，并使用明场显微镜计数细胞数。 在细胞培养罩内，根据制造商的说明，根据实验中的样品数量，在1.5 mL管中制备RT试剂，模板开关寡核苷酸，还原剂B和RT酶C的预混液。对于每个样品，将33.4μL预混液等分到PCR管中并储存在冰上。 按照制造商的说明中所述，根据目标细胞编号将细胞和水添加到预混液中。注意：通常回收50%-60%的细胞（即，在芯片上加载10，000个细胞时，使用5，000-6，000个细胞进行分析）。因此，请始终加载 10，000 个电池。如果细胞密度不允许这样做，则离心细胞并以较低的体积重悬。注意不要使芯片过载，因为这会导致芯片堵塞。此外，如果细胞未正确解离，则每个磁珠获得多个细胞的风险将增加，这需要在下游生物信息学处理中去除。 更换手套，将单细胞控制器移入细胞培养罩，并准备芯片，因为芯片仅覆盖有未密封的垫圈。注意：机器需要位于罩内，以防止暴露于受感染的细胞悬浮液和潜在的气溶胶。 将单细胞芯片添加到芯片支架中，并用50%甘油填充未使用的通道。 按照制造商的说明，将预混液、珠子和隔油添加到用于样品的通道中。 用垫圈盖住芯片，将芯片加载到控制器中，然后启动程序。注意：建议仅加载八个通道中的六个。乳液不当的问题经常发生在1号和8号车道上。该公司表示，所有车道都是独立的，这不应该发生;但是，如果可能的话，避免使用这两个通道，如果需要八个样本，请运行两个芯片。 程序完成后，取出芯片和垫圈。 使用多通道移液器并将100μL乳液转移到干净的PCR管中。确保每个孔都有均匀的白色，表明已经发生了完整的乳液。 换手套，清洁试管，然后将PCR试管转移到可以支持100μL反应的PCR机上。运行程序：53°C 45分钟;85°C 5分钟。 完成后，将样品储存在4°C。 此时，按照制造商的说明处理反应或在4°C下储存3天或-20°C储存1周。 在85°C下5分钟后，大多数包膜病毒将被灭活，根据正常操作程序从BSL-3中除去cDNA，并在BSL-1实验室中进行文库制备。注意：该实验需要作为三个生物学重复（例如，在三个不同的日期）进行，因为每个实验之间每种细胞类型的分化程度可能略有不同。生成的测序文库可以在一次测序运行中以不同的方式进行索引和测序。