JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Количественная оценка межбактериальной конкуренции с использованием одноклеточной флуоресцентной визуализации

Published: September 02, 2021
doi:
10.3791/62851
,
1Department of Earth, Marine, and Environmental Sciences,University of North Carolina

Summary

В этой рукописи описывается метод использования одноклеточной флуоресцентной микроскопии для визуализации и количественной оценки бактериальной конкуренции в кокультуре.

Abstract

Межбактериальная конкуренция может напрямую влиять на структуру и функцию микробиомов. В этой работе описывается подход флуоресцентной микроскопии, который может быть использован для визуализации и количественной оценки конкурентных взаимодействий между различными бактериальными штаммами на уровне одной клетки. Протокол, описанный здесь, предоставляет методы для передовых подходов к подготовке слайдов как на вертикальных, так и на перевернутых эпифлуоресцентных микроскопах, методах визуализации живых клеток и покадровой съемки, а также количественном анализе изображений с использованием программного обеспечения FIJI с открытым исходным кодом. Подход в этой рукописи описывает количественную оценку конкурентных взаимодействий между симбиотическими популяциями Vibrio fischeri путем измерения изменения площади с течением времени для двух коинкубированных штаммов, которые экспрессируют различные флуоресцентные белки из стабильных плазмид. Описаны альтернативные методы оптимизации этого протокола в бактериальных модельных системах, требующих различных условий роста. Хотя описанный здесь анализ использует условия, оптимизированные для V. fischeri,этот подход является высоковоспроизводимым и может быть легко адаптирован для изучения конкуренции между культивируемыми изолятами из различных микробиомов.

Introduction

В этой статье описывается метод количественной оценки бактериальной конкуренции на одноклеточном уровне с использованием флуоресцентной микроскопии. Структура и функция микробных сообществ часто формируется конкурентными взаимодействиями между микробами, и во многих случаях характеристика этих взаимодействий требует наблюдения различных бактериальных штаммов при коинкубации1,2,3,4,5,6,7,8 . Традиционно бактериальная конкуренция количественно определяется на уровне популяции путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) ингибиторных и целевых штаммов до и после периода коинфюбации2,9. Механизмы микробной конкуренции широко распределены среди бактерий и могут полагаться либо на диффузию, либо на клеточный контакт для ингибирования клеток-мишеней10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19.

Хотя бактериальные штаммы часто наблюдаются при коинкубации на популяционная уровень, в этой рукописи излагается анализ для одноклеточной количественной оценки бактериальной конкуренции. Кроме того, эта работа включает предложения по адаптации протокола для использования с другими видами бактерий. Хотя конкретные методики в данной статье используются для изучения контактозависимой внутривидовой конкуренции между штаммами симбиотической бактерии Vibrio fischeri20,21,22,они могут быть адаптированы для конкуренции между многими организмами. В этой статье приведены инструкции по настройке слайдов как на вертикальных, так и на перевернутых микроскопах, и весь анализ описан с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом FIJI23, чтобы метод мог использоваться исследователями, имея доступ к различным настройкам визуализации и программам анализа. Учитывая важность изучения микробной конкуренции как на популяционном, так и на одноклеточном уровне, этот метод станет ценным ресурсом для исследователей для количественной оценки конкурентных взаимодействий, особенно тех, которые не имеют доступа к проприетарному программному обеспечению для анализа.

Protocol

1. Оптимизация бактериальных штаммов Выберите два бактериальных штамма для одноклеточных бактериальных конкурсных анализов. Здесь используются два штамма V. fischeri: штамм-мишень (ES11424)и ингибиторный штамм (MJ1125),который, как известно, убивает целевой штамм с помощью системы секреции типа VI на хромосоме II (T6SS2)1,которая является контактно-зависимым механизмом уничтожения. Определите подходящие элементы управления для эксперимента. В этом примере подходящим контролем является инкубационная инкубации как штаммов мутантного ингибитора дикого типа, так и мутантных штаммов T6SS с целевым штаммом для количественной оценки эффекта Опосредованного T6SS убийства.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные средства контроля могут включать штамм-мишень, который экспрессирует необходимый ген (гены) иммунитета для предотвращения T6SS-зависимого убийства, или ингибитор мутантного штамма, экспрессирующего копии мутированных генов дикого типа в трансе для восстановления активности T6SS1. Когда это возможно, трансформируйте штаммы со стабильными плазмидами, кодирующие гены для различных флуоресцентных белков (например, GFP или RFP), чтобы визуально различать типы штаммов на микроскопе. Здесь штамм ингибитора помечается плазмидой, кодирующей GFP (pVSV102), а целевой штамм помечается плазмидой с кодированием dsRed (pVSV208)26.ПРИМЕЧАНИЕ: Если невозможно использовать стабильные плазмиды, флуоресцентные метки могут быть введены на бактериальную хромосому для визуализации27,28. В течение начального периода оптимизации изображения клональных культур помеченных штаммов под каждым из флуоресцентных фильтров, которые будут использоваться во время эксперимента, чтобы гарантировать, что клетки видны только в предполагаемом канале. Например, убедитесь, что штамм, помеченный GFP, виден только в канале FITC. 2. Подготовка агарозной прокладки Готовят раствор агарозы путем растворения 2% низкоплавкой агарозы (мас./об.) в mPBS. Ненадолго нагрейте раствор в микроволновой печи и вихре до полного растворения агарозы. Держите этот раствор в тепле, поместив его в водяную баню с 55°C до готовности к использованию. Дополнительные сведения о приготовлении прокладок агарозы см. в разделе Обсуждение. ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь mPBS был получен путем добавления 20 г/л NaCl к стандартному 1x PBS. Оберните кусок лабораторной ленты вокруг стеклянного слайда пять раз. Повторите этот процесс второй раз на том же слайде, чтобы расстояние между двумя кусками ленты было немного меньше ширины обтекаемоголиста (рисунок 1А). Например, при использовании 25 мм2 обложек, куски ленты должны быть расставлены примерно на 20 мм друг от друга.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя количество обмоток ленты вокруг слайда может быть изменено для регулировки толщины агарозной прокладки, важно, чтобы слои ленты были одинаковой высоты с обеих сторон слайда, чтобы агарозная подушка оставалась плоской. Пипетку нагревают раствором агарозы между двумя кусками ленты и сразу же засыпают чехловкой так, чтобы она упираться в куски ленты. Это гарантирует, что поверхность агарозной подушки останется плоской. Объем раствора агарозы, пипетированного на этой ступени, должен быть достаточным, чтобы покровный лист контактировал с жидкостью и выталкивал любые пузырьки в растворе агарозы. Для этой конкретной установки достаточно 200 мкл теплой агарозы. Дайте агарозной прокладке затвердеть при комнатной температуре в течение не менее 1 ч до анализа коинкубации. На этапе 2.2 получится агарозная прокладка примерно 20мм2. Разрежьте эту агарозную подушечку лезвием бритвы на четыре, 5 мм2 прокладки для использования для визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Прокладки агарозы могут быть изготовлены за одну неделю до эксперимента и храниться при 4°C в пустой, стерильной пластине Петри, запечатанных парапленкой для предотвращения высыхания. 3. Подготовьте штаммы к совместной инкубации Вытрите каждый штамм, который будет использоваться в коинкубационном анализе, от запасов -80 ° C на агаровые пластины LBS, дополненные соответствующими антибиотиками, и инкубировать в течение ночи при 24 ° C. Для этого примера используются три штамма: штамм ингибитора дикого типа, мутант системы секреции типа VI и штамм-мишень. На следующий день начните ночные культуры в биологическом дублировании, выбрав две колонии из каждого штамма и повторно ицедив их в среде LBS, дополненной соответствующими антибиотиками, и инкубируйте в течение ночи при 24 ° C с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. На следующее утро субкультуру каждый биологический препарат реплицируют 1:1000 в свежую среду LBS без антибиотиков и инкубируют при 24°C с встряхиванием в течение 4-5 ч или до тех пор, пока клетки не достигнут OD600 ~ 1,5.ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этапов 3.1, 3.2 и 3.3, возможно, потребуется оптимизировать для различных видов бактерий, поскольку скорость их роста может существенно различаться. Для этого анализа клетки были нацелены на то, чтобы находиться в середине фазы в начале анализа коинкубации. 4. Коинкубат бактериальных штаммов Начиная с среднелогарифмных культур с шага 3.3, измерьте и запишите оптическую плотность при 600 нм (OD600)для всех образцов. Нормализуйте каждый образец до OD600 = 1,0, что соответствует приблизительно 109 КОЕ/мл для V. fischeri,путем разбавления культуры средой LBS. Смешайте два конкурирующих штамма вместе в соотношении 1:1 в зависимости от объема, добавив 30 мкл каждого нормализованного штамма в маркированную трубку объемом 1,5 мл. Вихрь смешанной культуры в течение 1-2 с.ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях может быть целесообразно смешивать кокультуры в разных соотношениях. Например, когда один штамм растет намного быстрее, чем другой, может потребоваться начать более медленно растущий штамм с численным преимуществом, чтобы наблюдать за конкуренцией. Оптимизация также может потребоваться, если OD600 не соответствует аналогичному КОЕ/мл для обоих штаммов. Повторите шаг 4.3 для каждого биологического репликата и лечения. В примере, показанном здесь, это приведет в общей сложности к четырем трубкам со смешанными штаммами: двум биологическим репликатам со штаммом ингибитора дикого типа, смешанному с штаммом-мишенью, и двум биологическим репликам с мутантным штаммом системы секреции типа VI, смешанным с целевым штаммом. Чтобы убедиться, что конкурирующие клетки достаточно плотны для контактно-зависимого уничтожения при коинкубации на агаровой подушке, концентрируйте каждую смешанную культуру в 3 раза путем центрифугирования смешанной культуры в стандартной центрифужной трубке объемом 1,5 мл в течение 1 мин при 21 130 х г,отбрасывая надпосадочный материал и повторно идвигая каждую гранулу в среде LBS 20 мкл. Повторите для каждого образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые бактериальные клетки чувствительны к повреждению центрифугированием при высоком rcf; в таких случаях смешанную культуру можно центрифугировать в течение 3 мин при 4600 х г29. Кроме того, при количественной оценке контактно-зависимой конкуренции важно обеспечить достаточную плотность клеток на слайде для наблюдения за убийством. В этой статье «переполненные» методы лечения, где наблюдается убийство, имели приблизительно 10 клеток на 20мкм2; Дополнительные сведения см. в разделе Обсуждение. 5. Настройка слайдов При использовании вертикального микроскопа поместите ~5 мм2 агарозную прокладку на стандартный стеклянный слайд 1 мм. Нанесите 2 мкл смешанной культуры на агарозную прокладку и поместите на место крышку No1,5 (25 мм2). Пример см. на рисунке 1B. При использовании перевернутого микроскопа нанесите 2 мкл смешанной культуры на дно крышки No 1,5 чашки Петри 35 мм и поместите ~5 мм2 агарозную прокладку над пятном коинкубации. Поместите круглую стеклянную крышку диаметром 12 мм поверх агароузной прокладки. Пример см. на рисунке 1С. Повторите шаг 5.1 или 5.2, в зависимости от используемой установки микроскопа, для оставшихся трех смешанных культур, в результате чего будут получены четыре слайда или тарелки. Дайте слайдам посидеть на столешнице в течение примерно 5 минут, прежде чем перейти к шагу 6. Это позволяет клеткам оседать на агаровой подушке и исключает движение во время процесса визуализации. 6. Флуоресцентная микроскопия Начните с фокусировки на клетках, используя белый свет (фазовый контраст или ДВС-травматический эффект), чтобы свести к минимуму эффекты фотоотбеливания. Основываясь на среднем размере одной бактериальной клетки, используйте масляный объектив 60x или 100x. Настройте время экспозиции и параметры сбора данных для каждого канала таким образом, чтобы ячейки были видны в соответствующем канале с минимальным обнаружением фона.ПРИМЕЧАНИЕ: Целесообразно использовать разное время воздействия для разных каналов, но одно и то же время воздействия должно использоваться для всех биологических реплик и методов лечения для данного канала. Для каждого образца выберите не менее пяти полей зрения (FOV) и получите изображения в каждом соответствующем канале, используя настройки сбора из шага 6.2 (см. примеры на рисунке 2). Сохраните точки XY из каждого FOV, чтобы можно было получить одно и то же FOV в течение последней точки времени. Визуализация одного и того же FOV в каждый момент времени необходима для определения доли площади, занимаемой клетками-мишенями или ингибиторами на этапах анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере флуоресценция GFP обнаруживается с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 467 – 498 нм и эмиссионного фильтра 513 – 556 нм и имеет ложный зеленый цвет. Флуоресценция dsRed обнаруживается с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 542 – 582 нм и эмиссионного фильтра 603 – 678 нм и имеет ложный цвет пурпурного цвета. Через 2 ч повторите шаг 6.3 для каждого образца, используя ранее сохраненные точки XY(рис. 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется оптимизировать сроки последующих изображений для организмов с различными темпами роста или конкурентными механизмами. 7. Анализ изображений на ФИДЖИ Загрузите и установите программное обеспечение для обработки изображений FIJI, следуя инструкциям, приведенным здесь: https://imagej.net/Fiji/Downloads Откройте FIJI и импортируйте файлы изображений для анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев . Файлы TIFF будут использоваться для анализа изображений, хотя некоторые программы для получения изображений будут экспортироваться с использованием проприетарных типов файлов. FIJI может распознавать большинство проприетарных типов файлов, а изображения могут быть импортированы и проанализированы следующим образом. Для каждого изображения, полученного на шагах 6.3 и 6.4, преобразуйте изображение в оттенки серого, разделите каналы и начните с пороговых значений (Ctrl + Shift + T) и создания двоичной маски предварительно обработанного изображения(рисунок 3A,B).ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются настройки пороговых значений по умолчанию в FIJI. В некоторых случаях может потребоваться изменить эти настройки, и в этом случае одни и те же настройки должны использоваться для всех изображений в этом эксперименте. Установка масштаба на изображении (Анализ | Set Scale), используя соответствующие значения для установки микроскопии23. Набор измерений (Анализ | Установить измерения) и выберите Область.ПРИМЕЧАНИЕ: Другие измерения могут быть добавлены, если они подходят для эксперимента. Для примера анализа, показанного здесь, требуется только измерение площади объекта. Анализ частиц (Анализ | Analyze Particles) с использованием настроек по умолчанию(рисунок 3C). Если в образце есть мусор, может потребоваться отрегулировать размер или цикличность, чтобы отфильтровать неэлецитные частицы. Выберите Показать | Контуры таким образом, что результаты этого анализа будут включать пронумерованный контур всех анализируемых частиц(рисунок 3D).ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение контура на рисунке 3D с исходным изображением особенно важно на этапе оптимизации, чтобы гарантировать, что (1) анализируются все ячейки и (2) что любой мусор исключен из анализа. Экспортируйте измерения из шага 7.4(рисунок 3E)в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа и построения графиков. Повторите шаги 7.1 – 7.5 для всех каналов и изображений, полученных в ходе эксперимента. 8. Расчет процента от начальной целевой площади с течением времени Для каждого поля зрения, проанализированного в разделе 7, убедитесь, что экспортируемый файл содержит индивидуальное измерение площади для каждой анализируемой частицы. Начиная с флуоресцентного канала целевой деформации, рассчитайте сумму площади частиц для каждого отдельного поля зрения. Для двух биологических реплик с пятью FOV каждая это должно привести к десяти суммам областей на обработку в каждый момент времени. Рассчитайте процент начальной целевой площади с течением времени для каждого FOV, используя следующее уравнение: ( ) Повторите этот расчет для всех методов лечения и пообразите процент начальной целевой площади (результат уравнения из шага 8.2) для каждого лечения(рисунок 4A). Определить, наблюдается ли чистое увеличение целевой популяции (что указывает на рост), чистое снижение целевой популяции (указывающее на смерть) или отсутствие изменений (указывающих на отсутствие роста или смерти) для каждого лечения.ПРИМЕЧАНИЕ: Процент от начальной целевой области со значениями более 100 указывает на чистый целевой рост, а значения ниже 100 указывают на чистую целевую смертность. Процент от первоначальных целевых значений, которые остаются на уровне 100, указывают на отсутствие чистых изменений в целевой популяции. См. обсуждение предлагаемых последующих экспериментов. 9. Расчет процента начальной площади ингибитора с течением времени Повторите шаги с 8.1 по 8.3, на этот раз используя измерения, собранные из флуоресцентного канала ингибиторного штамма в разделе 7(рисунок 4B). Определить, наблюдалось ли чистое увеличение популяции ингибиторов (рост); чистое снижение популяции ингибиторов (смерть) или отсутствие изменений для каждого лечения. Значения, превышающие 100, указывают на чистый рост ингибиторов, а значения ниже 100 указывают на чистую смертность ингибитора.

Representative Results

Для визуализации и количественной оценки конкурентных взаимодействий между бактериями на уровне одной клетки был разработан и оптимизирован протокол для V. fischeri путем модификации нашего хорошо заведомо высококачественного анализа на основе КОЕ1,2. Этот метод использует GFP- и dsRed-кодирующие стабильные плазмиды для визуального различения различных штаммов V. fischeri. Конкурентный результат этих взаимодействий может быть количественно определен путем анализа изображений, полученных в результате этого анализа с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом FIJI. В качестве примера был проведен следующий эксперимент с использованием изолятов V. fischeri. Штамм-ингибитор содержит плазмиду, которая кодирует GFP, а штамм-мишень содержит плазмиду, которая кодирует dsRed. Учитывая, что T6SS2, кодируемый ингибитором, является контактно-зависимым механизмом уничтожения, были включены методы лечения, в которых клетки были либо переполнены (контакт с высоким содержанием клеток), либо диспергированы (контакт с низким содержанием клеток) на слайде, чтобы подчеркнуть влияние экспериментальной установки на окончательные результаты этого анализа. В данных выборки конкурирующие штаммы смешивали в соотношении 1:1 и инкубировали на агарозной прокладке в течение 2 ч, и были сделаны как начальные, так и конечные (2 ч) изображения. В качестве контроля мутантный штамм T6SS2 также был соинкубирован с целевым штаммом как в переполненных, так и в рассеянных условиях. Культуры каждого штамма готовили и соинкубировали, как описано выше, а слайды готовили, как показано на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения каждого экспериментального лечения с тем же полем зрения, изображенные в начальной и конечной точке времени. Для каждого лечения либо ингибитор дикого типа, либо мутантный штамм T6SS, скрывающий плазмиду, кодировавшую GFP, смешивали в соотношении 1:1 с целевым штаммом, укрывающим плазмиду, кодировавшую dsRed. В течение 2-х ч периода коинкубации с этой экспериментальной установкой растущие клетки V. fischeri могут проходить через 1-2 деления(рисунок 2;серые стрелки). На рисунке 2Аклеточный контакт был форсирован между мишенью и ингибитором путем концентрации смешанной культуры перед пятнистованием на слайде. Наблюдается, что множественные клетки-мишени округляются и/или исчезают в течение 2 ч, что согласуется с тем, что клетки-мишени устраняются ингибитором(рисунок 2;белые стрелки). Дополнительные сведения об интерпретации округления или лизирования целевых клеток см. в разделе Обсуждение. На рисунке 2Bта же коинкубация была замечена на слайде, на этот раз без концентрации смешанной культуры так, чтобы клетки оставались рассеянными и был минимальный контакт между штаммами на слайде. Здесь не наблюдается исчезновения или округления клеток-мишеней, что говорит о том, что штамм-мишень не был ингибирован в этом лечении. Рисунки 2C и 2D показывают те же переполненные и дисперсные методы лечения, описанные выше, на этот раз с использованием мутанта T6SS в качестве штамма-ингибитора. Не наблюдалось, чтобы клетки-мишени исчезали или округлялись при коинкубации с мутантом T6SS в переполненных или дисперсных условиях, что снова предполагает, что мишень не ингибировалась ни в одном из лечения. На рисунке 3 показан рабочий процесс анализа ФИДЖИ, используемый для количественной оценки конкуренции в этом протоколе. Было выбрано репрезентативное изображение из целевого канала(рисунок 3A)и создана двоичная маска с использованием пороговых настроек по умолчанию в FIJI(рисунок 3B). Масштаб изображения был установлен соответствующим образом для этой настройки микроскопии. Частицы анализировали с использованием параметра size = 0 – бесконечность, параметр циркулярности = 0,00 – 1,00, и был выбран Show Outlines (рисунок 3C). Результаты этого анализа частиц показаны как в виде пронумерованного контура каждой частицы(рисунок 3D),так и в виде таблицы со столбцами для номера частицы, имени файла (метки) и площади частицы вмкм2 (площадь)(рисунок 3E). На рисунке 4данные, полученные из рисунка 3E, отображаются и анализируются. На рисунке 4Апроцент начальной целевой площади в конечной точке времени представлен для каждого лечения в соответствии с этапом 8.2. Если процент первоначальной целевой площади превышает 100, это представляет собой чистое увеличение целевого показателя (т.е. рост) и наблюдается в условиях, когда целевая популяция существенно не ингибируется. Однако, если процент начальной целевой площади ниже 100, этот результат указывает на чистое снижение целевого показателя (т.е. смертность) и наблюдается в условиях, когда целевая популяция значительно ингибируется. Когда мишень была сокубирована с ингибитором дикого типа в переполненных условиях, данные показывают чистое снижение целевой области. Напротив, когда мишень была соинкубирована либо ингибитором дикого типа в условиях дисперсности, либо мутантом T6SS в переполненных или дисперсных условиях, данные показывают чистое увеличение целевой области. Процент начальной целевой области, когда мишень была соинкубирована ингибитором дикого типа в переполненных условиях, был ниже 100 и значительно ниже, чем у всех других методов лечения в соответствии с односторонним ANOVA, за которым последовал тест туки с множественными сравнениями во всех методахлечения (p < 0,0001). Эти данные указывают на то, что гибель клеток-мишеней зависит от функционального T6SS в ингибиторе, и подчеркивают важность экспериментальной установки, которая допускает достаточный контакт между клетками, чтобы обнаружить гибель клеток от контакт-зависимого механизма убийства. На рисунке 4B представлен процент начальной области ингибитора в конечной временной точке для каждого лечения. В этом примере чистый рост штамма ингибитора наблюдался во всех методах лечения. Тем не менее, процент начальной области ингибитора был значительно выше, когда ингибитор дикого типа был соинкубирован с мишенью в переполненных условиях по сравнению со всеми другими методами лечения в соответствии с односторонним ANOVA, за которым следовал тест Туки на множественные сравнения во всех методахлечения (p < 0,0001). Первоначально мы считали, что чистое увеличение площади ингибитора может быть обусловлено увеличением доступного пространства для роста по мере устранения клеток-мишеней. Однако это же увеличение роста ингибиторов не наблюдалось при дисперсных методах лечения, где ингибиторные клетки имели место для роста с начала коинкубации. В качестве альтернативы, этот результат может свидетельствовать о том, что питательные вещества, высвобождаемые из лизирующих клеток-мишеней, позволяют увеличить популяцию ингибиторов. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что штамм ингибитора устраняет мишень T6SS-зависимым образом только тогда, когда контакт между высокими клетками принуждается ккученностью клеток на слайде. Рисунок 1:Подготовка агарозовой прокладки и настройка слайдов для анализа коинкубации. (A) Установка для изготовления 2% агарозных подушечек. Пять слоев лабораторной ленты (зеленого цвета) обернуты вокруг крышки в двух точках, примерно на 20 мм друг от друга. Далее теплые 2% агарозы в mPBS (желтый) пипетируют между кусками ленты и сразу же покрывают крышкой 25 мм2 и дают затвердеть не менее 1 ч при комнатной температуре. Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать агарозную прокладку на ~ 5 мм2 части и используйте пинцет, чтобы перенести прокладку на новый слайд для визуализации. (B) При визуализации на вертикальном микроскопе поместите 5 мм2 агарозную прокладку непосредственно на слайд, следуйте за смешанной культурой (синим) и 12-миллиметровым круглым листом No 1,5. (C)При визуализации на перевернутом микроскопе обнаружите смешанную культуру непосредственно на стеклянной крышке No 1,5 скользящего дна 35-миллиметровой чашки Петри и поместите агарозовую прокладку поверх культуры, а затем второй 12-миллиметровый круглый скольжение крышки, чтобы сплющить агарозную прокладку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Замедленные изображения пятен коинкубации в условиях переполненности или рассеяния. (A)Репрезентативные изображения в начальных и конечных временных точках, где смешанная культура целевого и дикого типа ингибитора была сконцентрирована 3x до пятнистости на слайде, чтобы заставить клетку-клетку контактировать между штаммами. Белые стрелки в канале TRITC указывают на примеры клеток-мишеней, которые округляются или lyse на протяжении всего эксперимента. (B)Репрезентативные изображения, на которых смешанная культура целевого и дикого типа ингибитора была обнаружена без концентрации таким образом, чтобы клетки были диспергированы и между штаммами был минимальным клеточно-клеточный контакт. Серые стрелки в каналах FITC и TRITC указывают на примеры деления клеток на протяжении всего эксперимента. (C) Репрезентативные изображения, на которых смешанная культура мишени и T6SS-мутанта была сконцентрирована 3x до пятнистости на слайде, чтобы заставить клетку-клетку контактировать между штаммами. (D)Репрезентативные изображения, на которых смешанная культура мишени и T6SS-мутанта была замечена без концентрации так, что клетки рассеиваются и между штаммами происходит минимальный клеточный контакт. Шкала шкал = 5 мкм и согласована на всех изображениях; Канал TRITC имеет ложный пурпурный цвет, канал FITC ложного зеленого цвета. Деконволюция была выполнена на всех изображениях; фон был вычтен, а яркость/контрастность отрегулированы равномерно по всем изображениям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Рабочий процесс анализа FIJI. (A) Репрезентативное изображение для анализа. Этот рабочий процесс повторяется для обоих каналов во всех полях зрения и примерах. Шкала шкал = 5 мкм и согласована на всех изображениях; Канал TRITC имеет ложный пурпурный цвет, канал FITC ложного зеленого цвета. (B) Двоичная маска, созданная путем порогового значения изображения с использованием настроек по умолчанию в FIJI. (C) Пример настроек для анализа частиц, используемых в этой рукописи. Диапазон размеров = 0 – бесконечностьмкм2; циркулярность = 0,00 – 1,00; show = контуры. (D) Контур частиц, созданный как результат анализа частиц в (C) . Контур частицы в(D)следует сравнить с исходным изображением (A), чтобы убедиться, что все клетки были захвачены при анализе частиц. (E) Таблица результатов, созданная как результат анализа частиц в (C). Номер объекта (столбец 1) соответствует отдельным частицам (одной или нескольким ячейкам), очерченным и помеченным красным цветом на панели(D). Label = имя файла анализируемого изображения; Площадь = общая площадь частиц вмкм2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Выборочные данные для оценки того, ингибируется ли целевой штамм. Процент начальной площади в конечных временных точках для целевогоштамма (А)и ингибиторного штамма(В),при разных начальных плотностях клеток. Плотность скольжения указывает либо на начальную плотность клеток, которая переполнена (высокий клеточный контакт между штаммами), либо на более дисперсную (низкий клеточный контакт между штаммами), как описано на рисунке 2. Генотип ингибитора указывает на то, что либо штамм дикого типа, либо штамм мутанта T6SS (T6SS-)был соинкубирован с штаммом-мишенью. Звездочки указывают на значительную разницу в % изменений при сравнении всех методов лечения (односторонняя ANOVA, за которой следует тест туки с множественными сравнениями, сравнивающий все методы лечения; (p < 0,0001). Пунктирная линия указывает на отсутствие чистого изменения в области деформации между начальной и конечной точкой времени; % изменение > 100 указывает на чистое увеличение (т.е. рост), а % изменение < 100 указывает на чистое снижение (т.е. гибель клеток). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протокол, описанный выше, предоставляет мощный инструмент для количественной оценки и характеристики межбактериальной конкуренции на уровне одной клетки. Этот анализ, который был разработан путем модификации нашего анализа конкуренции на основе КОЕ на агаровых пластинах1,2,позволил визуализировать одноклеточную конкуренцию среди изолятов V. fischeri и предложены для оптимизации метода для широкого спектра систем и установок микроскопии. Хотя описанный здесь метод был оптимизирован для светового органного симбионта V. fischeri,его можно легко модифицировать для размещения множества разнообразных, культивируемых микробов. Важно отметить, что конкурентные механизмы могут регулироваться любым количеством переменных окружающей среды, включая температуру, соленость и вязкость30,31,32,33,34. Предыдущая работа подтвердила, что V. fischeri конкурирует с использованием контакт-зависимой системы секреции типа VI, которая активна на поверхностях30,что делает условия, описанные в этом анализе, подходящими для изучения конкуренции между примерами штаммов. Также важно учитывать начальную плотность клеток на слайде при количественной оценке бактериальной конкуренции. Учитывая, что контакт между клетками-мишенями и ингибиторами часто требуется для уничтожения, смешанная культура должна быть сконцентрирована таким образом, чтобы контакт между клетками был максимальным, а клетки оставались в одной плоскости на слайде. Клеточные культуры должны быть выращены до аналогичной оптической плотности (средняя фаза), а затем сконцентрированы для принудительного контакта, а не просто выращивания культур до более высокой оптической плотности из-за физиологических изменений клеток в разных фазах роста. В других системах условия культивирования и экспериментальная установка, возможно, потребуется модифицировать, чтобы гарантировать, что конкурентный механизм активен и может быть обнаружен в условиях коинкубации.

Агарозные прокладки, используемые в этом анализе, обеспечивают несколько преимуществ: они обеспечивают стабилизацию, чтобы клетки не перемещались свободно, и они предотвращают высыхание культуры в ходе эксперимента. Кроме того, если для эксперимента требуются химические индукторы, такие как изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG), их можно легко добавить в раствор агарозы. Тем не менее, важно отметить, что препарат агарозы, вероятно, необходимо будет скорректировать для разных систем. В примере, описанном выше, агарозную прокладку готовили растворяющей 2% агарозы (мас./об.) в 20 псу mPBS, что является стандартной соленостью, используемой в питательной среде V. fischeri. Кроме того, в некоторых случаях источник углерода может потребоваться добавить к агарозной прокладке, чтобы клетки могли расти и конкурировать в более длительных экспериментах. В таком случае mPBS в подушечках агарозы могут быть заменены любой питательной средой, хотя питательные вещества в питательной среде могут поступать с компромиссом дополнительной фоновой флуоресценции.

Без проприетарного программного обеспечения для анализа изображений может быть очень трудно получить количество отдельных клеток, когда контакт между клетками высок, что, как мы показываем здесь, необходимо для наблюдения контакт-зависимого убийства. Этот анализ был разработан, чтобы обеспечить альтернативный метод количественной оценки, который не полагается на количество отдельных клеток. Вместо этого общая площадь ячейки для каждого флуоресцентного канала используется для количественной оценки степени уничтожения между соинкубированными штаммами. Поскольку этот метод опирается на площадь, а не на количество отдельных ячеек, параметры пороговых значений по умолчанию обычно достаточны для определения общей площади ячеек. Точность пороговых значений может быть проверена путем деления общей площади объекта для репрезентативного поля зрения на средний размер клетки для модельного организма и сравнения этого расчетного числа клеток с ручным подсчетом клеток для того же изображения.

При коинкубациях между одним ингибитором и одним целевым (неубийцидным) штаммом прогнозируется чистый рост ингибитора. Как видно на рисунке 4,рост ингибиторов может быть значительно выше при лечении, где наблюдается убийство, по сравнению с методами лечения, где убийство не наблюдается, возможно, потому, что питательные вещества, высвобождаемые путем лизирования клеток-мишеней, позволяют штамму ингибитора расти быстрее. В примере, показанном здесь, чистая гибель мишени наблюдается, потому что конкуренция, опосредованная T6SS, приводит к лизису клеток-мишеней, когда мишень физически устраняется. Однако важно отметить, что не все конкурентные механизмы приводят к физическому устранению клеток-мишеней. Если мишень недееспособна токсином, который вызывает ингибирование роста, протокол, описанный здесь, может привести к тому, что видимая целевая популяция останется стабильной с течением времени, поскольку клетки-мишени больше не растут, а также не lyse. В таком случае было бы целесообразно сравнить результаты этого анализа с последующими тестами на жизнеспособность клеток-мишеней, такими как покрытие колониеобразующих единиц (КОЕ) или путем выполнения анализов живой смерти путем окрашивания йодидом пропидия или зеленым SYTOX35,36.

По сравнению с коинфекционными анализами, которые основаны на количестве КОЕ, этот анализ позволяет наблюдать и количественно оценивать пространственную структуру конкуренции между штаммами и отслеживать изменения в морфологии клеток-мишеней с течением времени. Например, известно, что клетки-ингибиторы, которые убивают с помощью T6SS, кодируют белки LysM-домена, которые разлагают клеточную стенку-мишень, что приводит к первоначальному округлённому округлёнью клеток, а затем лизису13,что мы наблюдали в примере, показанном на рисунке 2A. Кроме того, этот протокол может быть использован для отслеживания конкуренции с высоким разрешением в течение очень коротких временных масштабов. В примере, показанном здесь, значительное уменьшение целевой области наблюдается уже через два часа, когда клетки переполнены и между штаммами принудительно контакт клетка-клетка(рисунок 4). Анализ изображений, описанный здесь, также может быть выполнен с использованием конфокальной микроскопии, что позволило бы изучать бактериальную конкуренцию in vivo или в сложных биопленках, не нарушая пространственного распределения коинкубированных штаммов.

Таким образом, анализ, описанный здесь, направлен на обеспечение доступного и легко модифицируемого подхода к визуализации и количественной оценке бактериальной конкуренции на уровне одной клетки с использованием флуоресцентной микроскопии. Этот метод может быть применен к различным бактериальным изолятам и может быть использован для визуализации бактериальной конкуренции даже в сложных средах, таких как внутри хозяина или матрицы биопленки.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.N.S была поддержана грантом NIGMS R35 GM137886, а S.N.S была поддержана Программой стипендий для выпускников национальной оборонной науки и техники.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher 05-408-129
10 uL single channel pipette
1000 uL single channel pipette
20 uL single channel pipette
200 uL single channel pipette
Agarose Fisher BP165-25 Low melting agarose
Calculator
Cellvis 35 mm Dish Fisher NC0409658 #1.5 cover glass bottom
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
DAPI Nucleic Acid Stain Fisher EN62248 optional (if not using stable plasmids)
FIJI image analysis sofware ImageJ https://imagej.net/Fiji/Downloads open-source software
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher 12-545-81P #1.5 cover glass; 12 mm diameter
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Lens Cleaning Tissue Paper Fisher S24530
Parafilm Fisher 13-374-12
Petri Plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Razor Blades Fisher S65921
Semi-micro Cuvettes VWR 97000-586
Spectrophotometer
SYBR Green Nucleic Acid Stain Fisher S7563 optional (if not using stable plasmids)
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides Fisher 12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass Fisher 22-050-235 #1.5 cover glass, 25 mm2
Type F Immersion Oil Fisher NC0297589
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. 
Vortex
Water bath Used to keep agarose warm prior to pipetting
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g
mPBS (marine PBS) Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad
10X PBS Fisher ICN1960454
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS1-160P Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here
Sterile Vacuum Filter Units Fisher SCGVU01RE Used to filter-sterilize mPBS
Vacuum pump Used to filter-sterilize mPBS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (36), 8528-8537 (2018).
  2. Speare, L., Septer, A. N. Coincubation assay for quantifying competitive interactions between Vibrio fischeri isolates. Journal of Visualized Experiments. (149), e59759 (2019).
  3. Frost, I., et al. Cooperation, competition and antibiotic resistance in bacterial colonies. The ISME journal. 12 (6), 1582-1593 (2018).
  4. Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial communities: interactions to scale. Frontiers in Microbiology. 7, 1234 (2016).
  5. Souza, D. P., et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 (1), 1-9 (2015).
  6. Anderson, M. C., Vonaesch, P., Saffarian, A., Marteyn, B. S., Sansonetti, P. J. Shigella sonnei encodes a functional T6SS used for interbacterial competition and niche occupancy. Cell Host and Microbe. 21 (6), 769-776 (2017).
  7. Basler, M., Ho, B., Mekalanos, J. Tit-for-tat: Type VI secretion system counterattack during bacterial cell-cell interactions. Cell. 152 (4), 884-894 (2013).
  8. Guillemette, R., Ushijima, B., Jalan, M., Häse, C. C., Azam, F. Insight into the resilience and susceptibility of marine bacteria to T6SS attack by Vibrio cholerae and Vibrio coralliilyticus. PloS One. 15 (1), 0227864 (2020).
  9. Hachani, A., Lossi, N. S., Filloux, A. A visual assay to monitor T6SS-mediated bacterial competition. Journal of Visualized Experiments. (73), e50103 (2013).
  10. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  11. Ruhe, Z. C., Low, D. A., Hayes, C. S. Bacterial contact-dependent growth inhibition. Trends in Microbiology. 21 (5), 230-237 (2013).
  12. Wood, D. W., Pierson, L. S. The phzI gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 168 (1), 49-53 (1996).
  13. Smith, W. P., et al. The evolution of the type VI secretion system as a disintegration weapon. PLoS Biology. 18 (5), 3000720 (2020).
  14. Chen, L., Zou, Y., She, P., Wu, Y. Composition, function, and regulation of T6SS in Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research. 172, 19-25 (2015).
  15. Sana, T. G., Lugo, K. A., Monack, D. M. T6SS: The bacterial “fight club” in the host gut. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006325 (2017).
  16. Basler, M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1679), 20150021 (2015).
  17. Joshi, A., et al. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in Microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  18. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 589-600 (2016).
  19. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of Bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  20. Septer, A. N. The Vibrio-squid symbiosis as a model for studying interbacterial competition. Msystems. 4 (3), (2019).
  21. Tischler, A. H., Hodge-Hanson, K. M., Visick, K. L. Vibrio fischeri-squid symbiosis. eLS. , 1-9 (2019).
  22. Mandel, M. J., Dunn, A. K. Impact and influence of the natural Vibrio-squid symbiosis in understanding bacterial-animal interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1982 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Boettcher, K., Ruby, E. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna Scolopes. Journal of Bacteriology. 172 (7), 3701-3706 (1990).
  25. Doino, J. A., McFall-Ngai, M. J. A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid. The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).
  26. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  27. Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environmental Microbiology. 6 (7), 726-732 (2004).
  28. Koch, B., Jensen, L. E., Nybroe, O. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. Journal of Microbiological Methods. 45 (3), 187-195 (2001).
  29. Peterson, B. W., Sharma, P. K., Van Der Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Applied and Environmental Microbiology. 78 (1), 120-125 (2012).
  30. Speare, L., Smith, S., Salvato, F., Kleiner, M., Septer, A. N. Environmental viscosity modulates interbacterial killing during habitat transition. MBio. 11 (1), (2020).
  31. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), 61086 (2013).
  32. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).
  33. Bachmann, V., et al. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).
  34. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  35. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
  36. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15 (1), 36 (2015).

Tags

QuantificationInterbacterial CompetitionSingle-cell Fluorescence ImagingType VI Secretion SystemBacterial CompetitionCell AreaCulturable MicrobesAgarose PadLBS AgarOptical DensityNormalizationStrain Mixing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Smith, S., Septer, A. N. Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (175), e62851, doi:10.3791/62851 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image