Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem
Summary
Optogenetica is een krachtig hulpmiddel met uiteenlopende toepassingen. Dit protocol demonstreert hoe licht-induceerbare genexpressie in zebravisembryo’s kan worden bereikt met behulp van het blauw licht-responsieve TAEL / C120-systeem.
Abstract
Induceerbare genexpressiesystemen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologische processen. Optogenetische expressiesystemen kunnen nauwkeurige controle bieden over de timing, locatie en amplitude van genexpressie met behulp van licht als het inducerende agens. In dit protocol wordt een optogenetisch expressiesysteem gebruikt om licht-induceerbare genexpressie te bereiken in zebravisembryo’s. Dit systeem vertrouwt op een gemanipuleerde transcriptiefactor genaamd TAEL op basis van een natuurlijk voorkomende lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis. Wanneer het wordt verlicht met blauw licht, dimt TAEL, bindt het zich aan het verwante regulerende element C120 en activeert het transcriptie. Dit protocol maakt gebruik van transgene zebravisembryo’s die de TAEL-transcriptiefactor tot expressie komen onder controle van de alomtegenwoordige ubb-promotor. Tegelijkertijd drijft het C120-regulerende element de expressie van een fluorescerend reporter-gen (GFP) aan. Met behulp van een eenvoudig LED-paneel om activerend blauw licht te leveren, kan de inductie van GFP-expressie eerst worden gedetecteerd na 30 minuten verlichting en bereikt een piek van meer dan 130-voudige inductie na 3 uur lichtbehandeling. Expressie-inductie kan worden beoordeeld door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is een veelzijdige en eenvoudig te gebruiken aanpak voor optogenetische genexpressie.
Introduction
Induceerbare genexpressiesystemen helpen de hoeveelheid, timing en locatie van genexpressie te beheersen. Het bereiken van exacte ruimtelijke en temporele controle in meercellige organismen was echter een uitdaging. Temporele controle wordt meestal bereikt door toevoeging van verbindingen met kleine moleculen1 of activering van hitteschokpromotors2. Toch zijn beide benaderingen kwetsbaar voor problemen met timing, inductiesterkte en stressreacties buiten het doel. Ruimtelijke controle wordt voornamelijk bereikt door het gebruik van weefselspecifieke promotors3, maar deze aanpak vereist een geschikt promotor- of regulerend element, dat niet altijd beschikbaar is en niet bevorderlijk is voor inductie op subweefselniveau.
In tegenstelling tot dergelijke conventionele benaderingen hebben lichtgeactiveerde optogenetische transcriptionele activatoren het potentieel voor fijnere ruimtelijke en temporele controle van genexpressie4. Het blauw licht-responsieve TAEL/C120 systeem is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik in zebravis embryo’s5,6. Dit systeem is gebaseerd op een endogene lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis7,8. Het TAEL/C120-systeem bestaat uit een transcriptionele activator genaamd TAEL die een Kal-TA4-transactivatiedomein, een blauw licht-responsief LOV-domein (light-oxygen-voltage sensing) en een helix-turn-helix (HTH) DNA-bindend domeinbevat 5. Wanneer ze worden verlicht, ondergaan de LOV-domeinen een conformatieverandering waardoor twee TAEL-moleculen kunnen dimmeriseren, binden aan een TAEL-responsieve C120-promotor en transcriptie van een downstream-gen van belang kunnen initiëren5,8. Het TAEL/C120-systeem vertoont een snelle en robuuste inductie met minimale toxiciteit en kan worden geactiveerd door verschillende lichtafgiftemodaliteiten. Onlangs zijn verbeteringen aan het TAEL/C120-systeem aangebracht door een nucleair lokalisatiesignaal toe te voegen aan TAEL (TAEL-N) en door het C120-regulerende element te koppelen aan een cFos basale promotor (C120F) (Figuur 1A). Deze aanpassingen verbeterden de inductieniveaus met meer dan 15-voudig6.
In dit protocol wordt een eenvoudig LED-paneel gebruikt om het TAEL/C120-systeem te activeren en de alomtegenwoordige expressie van een reporter-gen, GFP, te induceren. Expressie-inductie kan kwalitatief worden gemonitord door fluorescentie-intensiteit te observeren of kwantitatief door transcriptniveaus te meten met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Dit protocol demonstreert het TAEL/C120-systeem als een veelzijdig, gebruiksvriendelijk hulpmiddel dat een robuuste regulatie van genexpressie in vivomogelijk maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van het optogenetische TAEL/C120-systeem om blauw licht-induceerbare genexpressie te bereiken. Dit systeem bestaat uit een transcriptionele activator, TAEL, die dimeriseert bij verlichting met blauw licht en transcriptie activeert van een gen van belang stroomafwaarts van een C120-regulerend element. Geïnduceerde expressie van een GFP-reporter kan worden gedetecteerd na slechts 30 minuten blootstelling aan licht, wat suggereert dat deze aanpak relatief snelle en responsieve kinetiek b…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Stefan Materna en leden van de Woo- en Materna-laboratoria voor nuttige suggesties en opmerkingen over dit protocol. We bedanken Anna Reade, Kevin Gardner en Laura Motta-Mena voor waardevolle discussies en inzichten tijdens het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) en de University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) aan S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
Referenzen
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemie. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).
