Ablazioni di volume profonde e controllate spazialmente utilizzando un microscopio a due fotoni nella Zebrafish Gastrula

Le interazioni cellula-cellula svolgono un ruolo vitale nello sviluppo. Le cellule forniscono segnali che i loro vicini diretti, o le cellule più lontane, possono percepire, influenzando così il loro destino e / o comportamento. Molti di questi segnali sono di natura chimica. Ad esempio, negli eventi di induzione ben caratterizzati, un gruppo cellulare produce molecole diffusibili che influenzano il destino di un’altra popolazione ^cellulare1. Altri segnali, tuttavia, sono meccanici; le cellule esercitano forze e vincoli sui loro vicini, che i vicini percepiscono e a cui ^rispondono2.

Un modo per studiare l’importanza di queste interazioni cellula-cellula in vivo è quello di eliminare alcune cellule e osservare lo sviluppo successivo. Sfortunatamente, le tecniche disponibili per rimuovere o distruggere le cellule sono limitate. Le cellule possono essere rimosse ^{chirurgicamente3,4}, utilizzando aghi o piccoli fili, ma tali trattamenti sono invasivi, non molto precisi e di solito eseguiti sotto uno stereomicroscopio, impedendo l’imaging immediato al microscopio. Inoltre, prendere di mira le cellule profonde implica perforare un buco nei tessuti sovrastanti, creando perturbazioni indesiderate. I fotosensibilizzatori geneticamente codificati, come KillerRed, sono stati utilizzati per indurre la morte cellulare tramite l’illuminazione della ^luce5. I fotosensibilizzatori sono cromofori che generano specie reattive dell’ossigeno dopo l’irradiazione della luce. Il loro principale limite è che richiedono lunghe illuminazioni di luce (circa 15 minuti), che possono essere difficili da ottenere se le cellule sono in movimento, e che inducono la morte cellulare attraverso l’apoptosi, che non è immediata.

Infine, le ablazioni laser sono state sviluppate e ampiamente utilizzate negli ultimi 15 anni6,7,8,9,10,11,12. Un raggio laser è focalizzato sulla cellula / tessuto mirato. Induce la sua ablazione attraverso il riscaldamento, la fotoablazione o l’ablazione indotta dal plasma; il processo coinvolto dipende dalla densità di potenza e dal tempo di ^{esposizione13}. La maggior parte dei protocolli di ablazione utilizza laser UV per la loro alta energia. Tuttavia, la luce UV viene assorbita e dispersa dai tessuti biologici. Pertanto, il targeting di cellule profonde richiede un’elevata potenza laser, che quindi induce danni nei tessuti più superficiali e fuori piano. Ciò limita l’uso dei laser UV alle strutture superficiali e spiega la loro risoluzione assiale relativamente bassa. L’ottica non lineare (la cosiddetta microscopia a due fotoni) utilizza proprietà non lineari della luce per eccitare un fluoroforo con due fotoni di circa mezza energia nel dominio infrarosso. Se applicato alle ablazioni, questo ha tre vantaggi principali. In primo luogo, la luce infrarossa è meno dispersa e meno assorbita della luce UV dai tessuti ^biologici14, consentendo di raggiungere strutture più profonde senza aumentare la potenza laser richiesta. In secondo luogo, l’uso di un laser pulsato a femtosecondi fornisce densità di potenza molto elevate, creando un’ablazione attraverso l’induzione del plasma, che, contrariamente al riscaldamento, non si diffonde ^{spazialmente15}. In terzo luogo, la densità di potenza che induce la formazione di plasma viene raggiunta solo nel punto focale. Grazie a queste proprietà, le ablazioni laser a due fotoni possono essere utilizzate per colpire con precisione le cellule profonde senza influenzare l’ambiente tissutale circostante.

Le migrazioni collettive sono un ottimo esempio di processi di sviluppo in cui le interazioni cellula-cellula sono fondamentali. Le migrazioni collettive sono definite come migrazioni cellulari in cui le cellule vicine influenzano il comportamento di una ^cellula16. La natura di queste interazioni (chimiche o meccaniche) e il modo in cui influenzano la migrazione cellulare possono variare notevolmente e spesso non sono del tutto comprese. La capacità di rimuovere le cellule e osservare come questo influisce sugli altri è fondamentale per svelare ulteriormente questi processi collettivi. Alcuni anni fa, abbiamo stabilito, utilizzando approcci chirurgici, che la migrazione del polster durante la gastrulazione del pesce zebra è una migrazione ^collettiva17. Il polster è un gruppo di cellule che costituisce le prime cellule internalizzanti sul lato dorsale ^{dell’embrione18}. Queste cellule, etichettate in verde nella linea transgenica Tg(gsc:GFP), si trovano in profondità nell’embrione, al di sotto di diversi strati di cellule epiblastiche. Durante la gastrulazione, questo gruppo guida l’estensione del mesoderma assiale, migrando dall’organizzatore embrionale al polo animale19,20,21,22,23 (Figura 1A). Abbiamo stabilito che le cellule richiedono il contatto con i loro vicini per orientare la loro migrazione nella direzione del polo animale. Tuttavia, una migliore comprensione delle basi cellulari e molecolari di questa migrazione collettiva comporta la rimozione di alcune cellule per vedere come questo influenza quelle rimanenti. Abbiamo quindi sviluppato ablazioni di volumi grandi e profondi utilizzando una configurazione di microscopia a due fotoni. Qui, dimostriamo l’uso di questo protocollo per recidere il polster nel suo mezzo e osservare le conseguenze sulla migrazione cellulare tracciando i nuclei etichettati con Histone2B-mCherry.