Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la Gastrula du poisson-zèbre

Les interactions cellule-cellule jouent un rôle essentiel dans le développement. Les cellules fournissent des signaux que leurs voisines directes, ou des cellules plus éloignées, peuvent percevoir, influençant ainsi leur destin et / ou leur comportement. Beaucoup de ces signaux sont de nature chimique. Par exemple, dans les événements d’induction bien caractérisés, un groupe cellulaire produit des molécules diffusibles affectant le devenir d’une autre population ^cellulaire1. D’autres signaux, cependant, sont mécaniques; les cellules exercent des forces et des contraintes sur leurs voisins, que les voisins perçoivent et auxquels ils ^réagissent2.

Une façon d’étudier l’importance de ces interactions cellule-cellule in vivo est d’éliminer certaines cellules et d’observer le développement ultérieur. Malheureusement, les techniques disponibles pour éliminer ou détruire les cellules sont limitées. Les cellules peuvent être enlevées ^{chirurgicalement3,4}, à l’aide d’aiguilles ou de petits fils, mais ces traitements sont invasifs, peu précis et généralement effectués sous stéréomicroscope, empêchant l’imagerie immédiate au microscope. De plus, cibler les cellules profondes implique de percer un trou dans les tissus sus-jacents, créant ainsi des perturbations indésirables. Des photosensibilisateurs génétiquement codés, tels que KillerRed, ont été utilisés pour induire la mort cellulaire via l’éclairage ^lumineux5. Les photosensibilisateurs sont des chromophores qui génèrent des espèces réactives de l’oxygène lors de l’irradiation lumineuse. Leur principale limite est qu’ils nécessitent de longs éclairages lumineux (environ 15 min), ce qui peut être difficile à réaliser si les cellules se déplacent, et qu’ils induisent la mort cellulaire par apoptose, qui n’est pas immédiate.

Enfin, les ablations au laser ont été développées et largement utilisées au cours des 15 dernières années6,7,8,9,10,11,12. Un faisceau laser est focalisé sur la cellule/le tissu ciblé. Il induit son ablation par chauffage, photoablation ou ablation induite par plasma; le processus impliqué dépend de la densité de puissance et du temps ^{d’exposition13}. La plupart des protocoles d’ablation utilisent des lasers UV pour leur haute énergie. Cependant, la lumière UV est à la fois absorbée et diffusée par les tissus biologiques. Ainsi, le ciblage des cellules profondes nécessite une puissance laser élevée, qui induit ensuite des dommages dans des tissus plus superficiels et hors plan. Cela limite l’utilisation des lasers UV aux structures superficielles et explique leur résolution axiale relativement faible. L’optique non linéaire (appelée microscopie à deux photons) utilise les propriétés non linéaires de la lumière pour exciter un fluorophore avec deux photons d’environ une demi-énergie dans le domaine infrarouge. Lorsqu’il est appliqué aux ablations, cela présente trois avantages principaux. Tout d’abord, la lumière infrarouge est moins diffusée et moins absorbée que la lumière UV par les tissus ^{biologiques14}, ce qui permet d’atteindre des structures plus profondes sans augmenter la puissance laser requise. Deuxièmement, l’utilisation d’un laser pulsé femtoseconde fournit des densités de puissance très élevées, créant une ablation par induction plasmatique qui, contrairement au chauffage, ne diffuse pas ^{spatialement15}. Troisièmement, la densité de puissance induisant la formation de plasma est atteinte au point focal uniquement. Grâce à ces propriétés, les ablations laser à deux photons peuvent être utilisées pour cibler avec précision les cellules profondes sans affecter l’environnement tissulaire environnant.

Les migrations collectives sont un excellent exemple de processus de développement dans lesquels les interactions cellule-cellule sont fondamentales. Les migrations collectives sont définies comme des migrations cellulaires dans lesquelles les cellules voisines influencent le comportement d’une ^cellule16. La nature de ces interactions (chimiques ou mécaniques) et la façon dont elles affectent la migration cellulaire peuvent varier considérablement et ne sont souvent pas entièrement comprises. La capacité d’éliminer les cellules et d’observer comment cela affecte les autres est essentielle pour démêler davantage ces processus collectifs. Il y a quelques années, nous avons établi – à l’aide d’approches chirurgicales – que la migration du polster lors de la gastrulation du poisson-zèbre est une migration ^collective17. Le polster est un groupe de cellules qui constitue les premières cellules internalisantes de la face dorsale de ^{l’embryon18}. Ces cellules, marquées en vert dans la lignée transgénique Tg(gsc:GFP), sont situées profondément dans l’embryon, sous plusieurs couches de cellules épiblastiques. Au cours de la gastrulation, ce groupe mène l’extension du mésoderme axial, migrant de l’organisateur embryonnaire au pôle animal19,20,21,22,23 (Figure 1A). Nous avons établi que les cellules ont besoin d’un contact avec leurs voisins pour orienter leur migration dans la direction du pôle animal. Cependant, mieux comprendre les bases cellulaires et moléculaires de cette migration collective implique d’enlever certaines cellules pour voir comment cela influence les autres. Nous avons donc développé des ablations de grands volumes profonds à l’aide d’une configuration de microscopie à deux photons. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce protocole pour couper le polster en son milieu et observer les conséquences sur la migration cellulaire en suivant les noyaux marqués avec Histone2B-mCherry.