Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu
Summary
Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus’un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.
Abstract
Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus’un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir. Patogenezin ve hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarının anlaşılması için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Bu çalışma, E. granulosus’un metacestod ve strobile formlarında lentiviral gen geçici transdüksiyonunun potansiyelini göstermektedir. Protoskoleces (PSC’ler) hidatik kistlerden izole edildi ve strobile solucanlara dönüşmek üzere spesifik bifazik kültür ortamına aktarıldı. Solucanlar, bir transdüksiyon süreci kontrolü olarak HEK293T hücreleri ile birlikte hasat edilmiş üçüncü nesil lentivirüs ile transfekte edildi. Strobillenmiş solucanlarda 24 saat ve 48 saat boyunca belirgin bir floresan tespit edildi ve bu da E. granulosus’ta geçici lentiviral transdüksiyonu gösterdi. Bu çalışma, tenyalarda lentivirüs bazlı geçici transdüksiyona yönelik ilk girişimi sunmakta ve yassı solucan biyolojisi üzerine yapılan deneysel çalışmalarda potansiyel etkileri olan umut verici sonuçları göstermektedir.
Introduction
Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae 1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus’un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.
Son yıllarda, genom dizilimi ve transkriptomik yöntemlerin gelişmesi nedeniyle, çeşitli araştırma grupları 7,8,9 tarafından yassı solucanlar üzerinde çok çeşitli moleküler çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, parazitler dünyasında, parazitik yassı solucanlarda gen transfer teknolojisindeki ilerlemeler, bazı protozoalar10,11,12 için geliştirilen yüksek oranda tekrarlanabilir geçici transdüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında hala sınırlıdır.
Viral dağıtım sistemlerinin kullanımı, son yirmi yılda transgen dağıtımı ve gen / protein araştırmaları için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır13. Lentivirus hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte eder, böylece postmitotik hücreleri enfekte etmeyi mümkün kılar14,15,16. Son kanıtlar, memeli hücrelerinde lentivirüs tabanlı bir transdüksiyon sistemi kullanmanın, önceki knock-in / knock-down tekniklerinin sınırlamalarının çoğunun üstesinden gelme potansiyeli sunduğunu göstermektedir. GFP ekspresyonu gibi uygun moleküler belirteçlere sahip ekspresyon lentiviral vektörlerinin tasarımı ve yapımı daha önce16 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, E. granulosus’un protoskolekslerinde ve strobilated solucanlarında GFP muhabir geninin lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendiriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesini anlamak için çok önemlidir27. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri12,27 de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önünde büyük bir engeldir. Bu çalışma, E. granulosus geçici transdüksiyonunda lentivirüsün m?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Tahran, İran’daki Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü’nden (NIMAD) 958680 ödül numarası altında Elit Araştırmacı Hibe Komitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
Referenzen
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A., Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
