A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in <em>Drosophila</em>

Joshua D. Walters; Jeffrey S. Hatfield; Brandon B. Baker; Trudy F. C. Mackay; Robert R. H. Anholt

doi:10.3791/62771

JoVE Journal > Behavior

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Verhalten

Высокопроизводительный анализ микропластинчатого питателя для количественной оценки потребления дрозофилы

Published: June 14, 2021

doi:

10.3791/62771

Joshua D. Walters*¹, Jeffrey S. Hatfield*¹, Brandon B. Baker¹, Trudy F. C. Mackay¹, Robert R. H. Anholt¹

¹Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics,Clemson University

Summary

Микропластинчатый питатель предлагает экономичный, высокопроизводительный метод количественной оценки потребления жидких пищевых продуктов при дрозофиле. 3D-печатное устройство соединяет 96-скважинную микропластину, в которой мухи размещены, с микропластиной с 1536 скважинами, из которой мухи потребляют питательный раствор с индикаторным красителем. Уменьшение объема раствора измеряется спектрофотометрически.

Abstract

Количественная оценка потребления пищи при дрозофиле используется для изучения генетических и физиологических основ связанных с потреблением признаков, их факторов окружающей среды, а также токсикологических и фармакологических эффектов многочисленных веществ. Немногие методы, применяемые в настоящее время, поддаются измерению с высокой пропускной способностью. Microplate Feeder Assay (MFA) был разработан для количественной оценки потребления жидкой пищи для отдельных мух с использованием поглощения. В этом анализе мухи потребляют жидкую пищевую среду из избранных скважин микропластины из 1536 скважин. Путем включения разбавленного индикаторного красителя в жидкую пищевую среду и загрузки известного объема в каждую скважину измерения поглощения скважины, полученной до и после потребления, отражают результирующее изменение объема (т.е. потребляемого объема). Для обеспечения высокопроизводительного анализа с помощью этого метода была разработана 3D-печатная соединительная муфта, которая позволяет сортировать мух по отдельности в 96-скважинные микропластины. Это устройство точно ориентирует микропластины из 96 и 1536 скважин, чтобы предоставить каждой мухе доступ к 4 скважинам для потребления, что позволяет количественно оценить пищевые предпочтения в дополнение к регулярному потреблению. Кроме того, устройство имеет барьерные полосы, которые переключаются между открытым и закрытым позициями, чтобы обеспечить контролируемую защитную миль и выпуск колонны образцов за один раз. Этот метод позволяет проводить высокопроизводительный измерения потребления водных растворов многими мухами одновременно. Он также может быть адаптирован к другим насекомым и для скрининга потребления питательных веществ, токсинов или фармацевтических препаратов.

Introduction

Drosophila melanogaster широко используется в качестве генетического модельного организма для изучения биологических основ потребления пищи и признаков, связанных с потреблением¹. По оценкам, 65% генов, вызывающих заболевания человека, имеют функциональные гомологи у мух, причем значительная часть из них экспрессируется в функционально эквивалентных тканях между мухами и людьми^2. Кроме того, размеры D. melanogaster, короткое межпостоятельное время, простота поддержания и генетическая податливость делают его привлекательной моделью для исследований потребления питательных веществ^3,⁴ и токсикологических и фармакологических эффектов различных веществ, включая инсектициды^5,загрязняющие вещества^6,фармацевтические препараты⁷и наркотики злоупотребления^8,^9,^10.

Во многих случаях изучение таких признаков требует точной количественной оценки потребления. Методы количественной оценки потребления разнообразны и включают в себя анализ CApillary FEeder (CAFE)^11,анализ MAnual FEeding (MAFE)^12,анализ¹³реакции на расширение приучков (PER), экстракцию индикаторного красителя^14,^15,экстракцию индикатора олигонуклеотида¹⁶и экстракцию радиоизотопов^5,^17. Недавние усилия были сосредоточены на повышении пропускной способности этих анализов, как в анализе Expresso¹⁸ или в системе¹⁹Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) на основе пластин. Несмотря на их полезность, эти анализы могут быть сложными, дорогостоящими или трудоемкими, что препятствует их использованию в исследованиях с высокой пропускной способностью.

Рисунок 1:Компоненты анализа microplate Feeder. (A) 3D-рендеринг собранного анализа микропластинчатого питателя. Микропластина 1536 скважин ориентирована 3D-печатным соедиником таким образом, что каждая скважина нижней 96-скважинной микропластины имеет доступ к четырем скважинам верхней микропластины 1536 скважин. Доступ к колодцам можно контролировать, регулируя положение барьерных полос, прорезных через сцепное оборудование. (B) Графическое представление каждой скважины микропластине питателя. Растворы для потребления сохраняются в каждой скважине с использованием герметизируемой пленки, которая была перфорирована для обеспечения доступа мухи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Обзор процедур в анализе microplate Feeder. На рисунке показана блок-схема, соответствующая шагам 4.1-5.8 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы преодолеть эти препятствия, микропластинчатый фидерный анализ (MFA; Рисунок 1) был разработан. В этом анализе мухи размещаются индивидуально в 96-скважинных микропластинях. Каждая микропластиня соединена с 1536-скважинной микропластинкой с помощью специального 3D-печатного устройства. Устройство точно ориентирует две пластины таким образом, что каждая муха в соответствующем колодце 96-скважинной плиты имеет доступ к 4 скважинам микропластины 1536 скважин. Используя бездонную пластину 1536 скважин и герметизирующих пленок, растворы дозируются в отдельные скважины и перфорируются точными иглами диаметром 0,25 мм для обеспечения доступа к мухам. Критически важно, что разрешение потребления непосредственно с микропластины позволяет проводить немедленные измерения на основе поглощения с помощью считывателя микропластин. Разбавленный индикаторный краситель включают в среду потребления, а изменение абсорбсии после воздействия используют для определения потребляемого объема(Фиг.2 и Фиг.3). Поскольку жидкость в каждой скважине приближается к столбу жидкости, объемные различия будут проявляться в виде различий в высоте колонны. (Рисунок 3A) Согласно закону Бира-Ламберта²⁰:

где A — поглощение, ε — коэффициент молярного поглощения для затухающего анализируемого, l — длина оптического пути, а c — концентрация отухающего анализируемого. Таким образом, при постоянном молярном коэффициенте поглощения и концентрации изменения поглощения обусловлены исключительно изменениями оптического светового пути, т. е. уровня жидкости в данной скважине. Измеряя поглощение до и после воздействия, пропорциональное изменение поглощения отражает пропорциональное изменение объема(рисунок 3B).

Рисунок 3:Количественное определение объема скважины на основе поглощения. (A) Падающие светы известной входной интенсивности(I₀₎проходят через каждую скважину. Затухание света при разных объемах заполнения дает различную интенсивность выхода(I),демонстрируя линейную зависимость между объемом и поглощением. (B)Эмпирическое измерение поглощения по сравнению с объемом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Исходя из изменения объема, количество любого проглоченного соединения может быть рассчитано по его известной концентрации в питательном растворе. Детали, необходимые для анализа, являются низкими по стоимости и имеют высокую степень повторного использования, что значительно снижает повторяющуюся стоимость анализа. Таким образом, эта процедура предлагает доступный, высокопроизводительный метод точной количественной оценки потребления.

Protocol

1. Подготовка пластины для голодания Взвесьте 1,5 г агарозы в стеклянный стакан емкостью 250 мл. Добавьте в моккер 100 мл дистиллированногоH2O. Периодически в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за закваской, так как агароза склонна к кипению. Перелейте расплавленную агарозу в желоб реагента и дозируйте 80 мкл расплавленной агарозы в каждую скважину 96-скважинной микропластины с помощью многоканальной пипетки. Дайте пластинам отверждаться, пока они покрыты комнатной температурой. Охладите оставшуюся агарозу на срок до недели в герметичном пакете и повторно расплавите его для изготовления дополнительных пластин. 2. Сортировка мух и голодание Подготовьте муфты, вставив барьерные полосы в каналы барьерной полосы. Если барьерные полосы слишком свободны, обведите их вокруг пальца, чтобы придать им кривизну, чтобы удерживать их в каналах. Прикрепите муфту к пластине для голодания. Не используйте соединитель для манипулирования пластиной, так как соединитель может соскользнуть. Убедитесь, что муфты правильно ориентированы (т. Е. Убедитесь, что угловой угол соединителей соответствует угловой углу микропластины). Под наркозомСО2 (Таблица материалов)отсортируют 3-5-дневных мух. Загружайте отдельных мух колонной в пластину голодания.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мухи загружаются колонной, рекомендуется распределять группы образцов вниз по рядам пластины, а не вниз по столбцам (см. Рисунок 4 для примера компоновки пластин). Закройте каждый столбец по мере его заполнения, отрегулировав его барьерную полосу в закрытое положение. Рисунок 4:Репрезентативная компоновка пластины голодания. Диаграмма показывает организацию контроля испарения и самцов и самок мух в 96-скважинной пластине, используемой в этом исследовании. Также могут использоваться альтернативные конфигурации, включая чередующиеся ряды самцов и самок с регуляторами испарения в рядах A и H. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Тщательно запишите макет образца внутри микропластины. Как только пластина голодания заполнена, позвольте мухам спонтанно восстановиться после удаления CO2 и голодайте их в течение 6 часов, начиная с их первоначального времени анестезии. 3. Приготовление жидкой пищи ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте жидкую пищу свежей каждый день. Приготовьте 10 мг/мл раствора красителя FD&C Blue #1 в дистиллированномH2O.ПРИМЕЧАНИЕ: Он может храниться при комнатной температуре до 6 месяцев. Приготовьте 10 мл жидкой пищи (4% сахарозы, 1% дрожжевого экстракта, 40 мкг/мл FD&C Blue #1) в конической трубке объемом 15 мл, растворив 0,4 г сахарозы и 0,1 г дрожжевого экстракта в 10 мл дистиллированногоH2O. Вихряйте трубку до полного растворения твердых веществ. Добавьте 40 мкл раствора красителя и повторно переверглите трубку для гомогенизации раствора. Переложите жидкую пищу в шприц объемом 10 мл с наконечником с фильтром 0,45 мкм. Фильтруйте ~1,5 мл раствора за раз в микроцентрифужную трубку 1,7 мл. Отложите шприц, содержащий раствор, и процедить дополнительный раствор по мере необходимости во время приготовления питательной пластины. 4. Подготовка питательной пластины ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обрабатывайте пластины кормушки после заполнения, чтобы предотвратить образование пузырьков или капель в колодец, которые могут повлиять на показания абсорбции. Подготовьте питательную пластину, запечатав дно микропластины из 1536 скважин уплотнительной пленкой. Используйте уплотнительное весло, чтобы тщательно прилипать к пленке. Обрежьте лишнюю пленку с левого и правого краев лезвием бритвы. Дозировать 10 мкл отфильтроированной жидкой пищи в колонке (см. Рисунок 5 для иллюстрации) в соответствующие колодцы микропластины 1536-скважины. Распределяют в верхний левый колодец для каждого кластера из четырех скважин (см. Рисунок 5 для иллюстрации). Рисунок 5:Порядок заполнения и расположение скважины для питательной плиты скважины 1536. Схема иллюстрирует шаг 4.2 протокола. Стрелки показывают порядок, в котором питательный раствор вводится в пластину питателя по одной колонке за раз от колонки 1 до 12. Образец B1 увеличен, чтобы показать пример расположения питательных растворов для анализов 1 и 2 выбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. После того, как все колодцы заполнены, нанесите уплотнителюзную пленку на верхнюю часть пластины. Используйте уплотнительное весло, чтобы тщательно прилипать к пленке. Обрежьте лишнюю пленку с левого и правого краев лезвием бритвы. Повторите для нужного количества пластин. Центрифугировать пластины при 200 х г в течение 10 с для оседающей жидкости. Не позволяйте пластине охлаждаться, так как это может привести к накоплению конденсата в скважинах, заслоняя показания поглощения. 5. Экспозиция Как только мухи будут готовы к анализу потребления, перфорируют колодцы на верхней поверхности пластины игольчатым пробным инструментом, оснащенным иглой диаметром 0,25 мм. Используйте тот же порядок перфорации, который использовался при дозирования растворов. Переверните плиту и перфорируют колодцы на дне. Протрите иглу между растворами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Будьте осторожны, чтобы не коснуться перфораций, так как это выхватило раствор из колодцев. Считывайте поглощение пластины при 630 нм без крышки. Поместите внутреннюю крышку на верхнюю уплотнителевую пленку, чтобы убедиться, что конденсационные кольца окружают перфорированные скважины. Поместите внешнюю крышку на тарелку. Поместите питательную пластину лицевой стороной вверх на муфту таким образом, чтобы направляющие выровняли соответствующие отверстия пластины подачи и пластины голодания. Убедитесь, что соединитель и пластины правильно ориентированы (т. Е. Убедитесь, что угловой угол соединицы и пластины совпадают). Оберните резинки вокруг верхней и нижней пластин, чтобы удерживать соединитель вместе. Проверьте выравнивание и зазоры между питательной пластиной и муфтой. После того, как все фидерные пластины загружены на муфты, откройте колодцы для плит, отрегулировав барьерные полосы на соединителях. Поместите соединитель/пластинчатые узлы во вторичный контейнер. Каждый дополнительный контейнер может вместить до шести сборок. Поместите нижнюю половину коробки для пипетки, содержащую размоченные бумажные полотенца, в каждый дополнительный контейнер, чтобы обеспечить влажность. Закройте крышку вторичных контейнеров и перенесите их в контролируемую среду (25 °C, влажность контролируется, циклы света: темнота 12 ч). Дайте мухам поесть в течение 22 ч. После 22-х ч экспозиции проверьте каждую пластину на наличие мертвых мух и соответствующим образом обновите макет пластины. После того, как все пластины проверены, обезболивайте мух в массовом порядке, закачивая CO2 внутрь вторичного контейнера. После ~ 60 с убедитесь, что все мухи обездвижены. Аккуратно утрамбуйте мух в пластину голодания и замените пластиковые барьерные полосы. Снимите фидерные пластины для считывания. Перечитайте поглощение пластины при 630 нм. Повторяйте до тех пор, пока не будут прочитаны все пластины. 6. Анализ данных ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть выполнен с помощью предпочтительного программного пакета исследователя. Опустите мух, которые погибли во время 22-часового воздействия. Для каждой скважины рассчитайте потребляемый объем следующим:C – Потребляемый объем (мкл)V – Начальный объем скважины (т.е. 10 мкл)ABS0 – Предэкспозисное поглощениеABS1 – Постэкспозиционное поглощениеПРИМЕЧАНИЕ: Потребление в расчете обозначается как положительный объем. Чтобы учесть испарение, вычтите средний объем испарения из значений расхода мухи в соответствующих пластинах. Для испытаний с 2 выбором/предпочтениями отрегулируйтекаждую скважину по соответствующему решению, например, отрегулируйте скважины «выбора 1» по «выбору 1» в системах управления испарением. После корректировки на испарение сбрасывание любых образцов со значением расхода менее нуля. Для тестирования с 2 вариантами вычислите предпочтения для каждой скважины, а также:P – Индекс предпочтений (положительное направление указывает на предпочтение)FA – Объем потребляемой жидкой пищи, содержащей добавку (Выбор 2)FN – Объем потребляемой нормальной жидкой пищи (Выбор 1) 7. Протокол мойки микропластин и муфт. ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы предотвратить повреждение нижней части микропластин, так как повреждение может повлиять на уплотнение. Снимите пленки и этикетки с микропластин 1536 скважин. Разделите муфты и барьерные полосы. Поместите барьерные полосы в герметичный контейнер, например в бутылку. Промыть барьерные полоски, энергично встряхнув в серии теплой водопроводной воды, мягкого моющего раствора, теплой водопроводной воды, а затем дистиллированногоH2O. Промыть 1536-колодезные микропластины и муфты под теплой водопроводной водой. Для микропластин пропускайте водопроводную воду через колодцы каждой микропластины, чтобы очистить как можно больше раствора и мусора. При необходимости используйте наконечник пипетки для вытеснения мусора; не используйте металлическую или стеклянную посуду на пластинах. Накройте каждую пластину и соединитель мягким моющим раствором (например, 1% v/v Aquet). Для тарелок протрите поверхности рукой в перчатках. Для муфт используйте щетку. Тщательно промойте каждую тарелку водопроводной водой, а затем дистиллированнойH2O. Убедитесь, что колодцы специально промывны под потоком воды. Дайте пластинам и муфтам высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Хранить в чистом бункере до использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не обращайтесь с 1536-колодезными микропластинками без перчаток. Остаточные масла из кожи могут препятствовать герметизации, что приводит к утечке и испарению скважин.

Representative Results

Чтобы определить, существуют ли какие-либо корреляции между скважинами отдельных плит, испарение было количественно определено для каждой скважины (n = 96 скважин/плит для трех плит). Было обнаружено, что испарение составило -0,036 мкл ± 0,003 мкл (среднее ± SEM на протяжении всего времени). (Рисунок 6A) Корреляции Пирсона были рассчитаны для оценки тенденций между испарением и местоположением скважины. Коэффициент корреляции(рисунок 6B,C)для испарения по отношению к рядам составил -0,04 (p = 0,4949), а для испарения против столбцов – -0,23 (p = 0,0001). Впоследствии группы были распределены между столбцами, чтобы смягчить мягкие, но статистически значимые корреляции между столбцами. Рисунок 6:Испарение в MFA. (A)Распределение плотности изменений испарения со средним ± SD, обозначенным пунктирной линией. Корреляции между испарением и строками(B)или столбцами(C)с коэффициентом корреляции Пирсона и p-значением, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Чтобы установить действительность протокола, потребление было количественно определено для 3-5-дневных мух Canton-S B (n = 36 / пол / пластина и n = 24 контроля испарения / пластина для трех пластин)(рисунок 7). Испарение между контрольными скважинами существенно отличалось от нуля (-0,030 мкл ± 0,006 мкл, p = 4,81 х 10-6;один образец t-тест против нуля). Два образца были исключены (оба мужского пола) из набора данных, один из-за смерти во время ночного воздействия, а другой из-за отрицательного значения потребления после корректировки на испарение. Это дало > 99% коэффициент удержания выборки. Рисунок 7:Количественная оценка потребления с использованием MFA. (A) Потребление визуализировали с использованием изготовленной на заказ стеклянной камеры. Мухи наблюдали питье из перфорированных колодцев и демонстрировали синее окрашивание брюшной полости после приема окрашенного раствора. См. также Дополнительное видео S.1. (B)Значения потребления (среднее ± SEM) среди испарителя, самцов мух и самок мух. Попарный пост-hoc t-тестс неравной дисперсией проводился для статистических сравнений, причем значимость обозначается барами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Впоследствии была построена модель дисперсионного анализа (ANOVA), описанная Y = μ + S + P + SxP + e, с Y в качестве группового среднего, μ как общее среднее, S как фиксированный эффект пола, P как фиксированный эффект пластины, SxP как взаимодействие между полом и пластиной и e как остаточная изменчивость. ANOVA не показала значительной вариабельности от пластины к пластине (p = 0,671) или специфических для пола взаимодействий с пластинами (p = 0,104) для потребления, в то время как один только пол внес значительный вклад в наблюдаемую вариацию потребления (p = 4,17 x 10-18). Пост-специальный t-тестпоказал, что самцы потребляли значительно меньше, чем женщины (0,500 мкл ± 0,017 мкл против 0,811 мкл ± 0,028 мкл, p = 1,13 х 10-17,два образца t-тестас неравной дисперсией). Чтобы продемонстрировать, что анализ может быть использован для количественной оценки предпочтений с двумя вариантами выбора, мухам был предоставлен выбор между 4% раствором сахарозы с 1% дрожжевым экстрактом и 4% раствором сахарозы, дополненным 15% этанолом и 1% дрожжевым экстрактом. Как мужчины, так и женщины показали подавляющее предпочтение раствору с этанолом и дрожжевым экстрактом с индексами предпочтения 0,974 ± 0,026 для мужчин и 0,876 ± 0,06 для женщин (средний ± SEM)(рисунок 8). Рисунок 8:Количественная оценка предпочтений с использованием МИД. Потребление 4% сахарозы против 4% сахарозы, дополненной 15% этанолом и дрожжевым экстрактом для самцов и самок мух (n = 33 для каждого пола). Самцы мух потребляли больше раствора этанола, чем контрольный раствор сахарозы (0,511 мкл ± 0,029 мкл против 0,00 мкл ± 0,017 мкл; p = 4,06e-10;тест с двумя образцами t). Самки мух также потребляли больше раствора этанола, чем контрольный раствор сахарозы (0,939 мкл ± 0,044 мкл против 0,132 мкл ± 0,044 мкл; p = 7,38e-17;тест с двумя образцами t). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительное видео S.1: На видео показано, как муха кормится из перфорированного колодца и накапливает синее брюшное окрашивание при приеме окрашенного раствора. Неподвижное изображение показано на рисунке 7A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительный файл S.2: Микропластинчатый питатель Пробирная муфта. Это 3D-печатная конструкция соединительного муфты, используемого в MFA. Печатный материал Нейлон PA12 был использован для МИД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл S.3: Барьерная полоса для микропластинчатого питателя. Он содержит конструкцию пластиковых барьерных полос, используемых для переключения воздействия мух на пластину кормушки. Одна муфта может использовать до двенадцати барьерных полос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл S.4: Инструкции по распаковке и изготовлению для анализа микропластинчатого питателя. Инструкции по распаковке муфты и барьерных полос включены. Инструкции по изготовлению включены для внутренней крышки, наружной крышки и вторичного контейнера, используемого для ограничения испарения во время воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл S.5:Сравнение стоимости анализа Microplate Feeder (MFA) и анализа CApillary FEeder (CAFE) с одним выбором из 1. Тестирование 72 мух / пола для одной линии потребует двух комплектов оборудования MFA (муфты + пластины + барьерные полоски), в то время как CAFE потребуется только 1 капилляр для каждого флакона культуры. Несмотря на большую разницу в первоначальных инвестициях для МИД, большая разница в повторяющихся затратах ($14,80 против $46,08 соответственно) позволит возместить первоначальные затраты после тестирования только 4 линий (точка безубыточности). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В исследовании описывается новый протокол количественной оценки потребления дрозофилы:анализ микропластинчатого фидерного анализа (MFA). В этом анализе мухи потребляют из герметичных скважин микропластине 1536 скважин через перфорации контролируемого размера(рисунок 1, рисунок 2; Дополнительное видео S.1). Поскольку жидкая пища окрашивается и обеспечивается через микропластинку, измерения оптического поглощения пищи могут быть получены с помощью микропластинового спектрофотометра(рисунок 3). Таким образом, потребление определяется путем сравнения поглощения до и после потребления, а затем применения этой пропорции к известному объему, дозируемого до потребления. Это было проверено эмпирически путем измерения поглощения различных объемов окрашенной среды(рисунок 3B).

Для разработки этого анализа требовалось устройство, которое могло бы использовать количественную оценку потребления на основе поглощения. Тестирование мух в формате микропластины привлекательно, поскольку оно дополняет микропластинку, используемую для дозирования пищи, и обеспечивает гибкость в выборе из нескольких форматов пластин (например, форматов 6-, 12-, 48- или 96-скважинных) путем настройки геометрии соединителя. Формат микропластины с 96 скважинами был выбран для индивидуальной культуры мух.

3D-печатное устройство(рисунок 1)точно ориентирует питающую пластину на 1536 скважин с 96-скважинной культурной пластиной, предоставляя каждой мухе доступ к 4 скважинам питающей пластины для потребления. Кроме того, для обеспечения достаточного времени для распределения мух в табличку корпуса и для контроля начала анализа устройство включает в себя переключение барьерных полос, содержащих мух в их соответствующих колодцах, и предотвращение нарушений. Предоставляются файлы, необходимые для приобретения или модификации этих деталей(Дополнительные файлы S.2–S.3),а также необходимые инструкции по изготовлению соответствующих частей(Дополнительный файл S.4).

MFA предоставляет простой метод высокой пропускной способности, который дополняет более сложные методы мониторинга пищевого поведения дрозофилы^18,^21,^22. MFA предлагает множество преимуществ по сравнению с другими методами, используемыми для количественной оценки потребления пищи. Пропускная способность увеличивается за счет количественной оценки потребления с помощью пластинчатого считывателя. Это исключает ручные измерения и исключает ручной ввод данных. Данные также поддаются программному извлечению и обработке. Кроме того, более высокая пропускная способность увеличивает возможное количество биологических реплик, особенно по сравнению с конструкциями коммунальных питательных машин, что значительно увеличивает мощность для обнаружения небольших различий в потреблении. Используя MFA, один экспериментатор может количественно оценить потребление или предпочтение более 500 мух за ночной прогон анализа. Перекрывая прогоны анализа, более 2000 мух могут быть протестированы за 5-дневный период. Наконец, существует долгосрочная экономия средств за счет возможности повторного использования микропластин и муфт(Дополнительный файл S.5). Используя MFA, ориентировочная стоимость одного анализа может составлять всего 14,80 долларов США, а авансовая стоимость оборудования составляет 127,60 долларов США. Используя классический анализ CApillary FEeder (CAFE), который требует дорогостоящих прецизионных микрокапилляров, ориентировочная стоимость одного анализа для сопоставимого количества реплик составляет 46,08 долл. Таким образом, несмотря на первоначальные инвестиции в приобретение необходимого оборудования, сокращение повторяющихся затрат может привести к существенной экономии, особенно в тех случаях, когда проводится повторное тестирование.

Как и все анализы, МИД имеет определенные ограничения. Главным образом, он требует доступа к микропластинчатому спектрофотометру, способного считывать 1536-скважинные микропластины. Кроме того, опора на измерения поглощения для количественной оценки делает метод восприимчивым к оптическим помехам. Это проявляется в виде отрицательных значений потребления для небольшого подмножества протестированных образцов. Питательные вещества, лекарства, фармацевтические препараты или токсины, представляющие интерес, также должны быть водорастворимыми, чтобы быть совместимыми с анализом.

Несмотря на свои ограничения, этот метод предлагает высокопроизводительный метод количественной оценки потребительского поведения у дрозофилы. Кроме того, соединительное устройство может быть легко модифицировано для принятия многих форматов пластин, что позволяет ему вмещать различные виды насекомых.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками (U01 DA041613) для TFCM и RRHA.

Materials

0.25 mm Diameter Needers	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	–	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO₂Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	–	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	–	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 15396-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422

Referenzen

Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS ONE. 4 (6), (2009).
Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480 (2020).
Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834 (2019).
Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87 (2015).
Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776 (2020).
Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
IUPAC. . Compendium of Chemical Terminology (The “Gold Book”). , (1997).
Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Diesen Artikel zitieren

Walters, J. D., Hatfield, J. S., Baker, B. B., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila. J. Vis. Exp. (172), e62771, doi:10.3791/62771 (2021).