用于果蝇消费量化的高吞吐量微板馈线分析

1. 饥饿板准备 将 1.5 克的阿加罗斯称重到 250 毫升玻璃烧杯中。 在烧饼中加入 100 mL 蒸馏 H2O。 微波间歇性，直到玫瑰完全熔融。注意：观察烧甲机，因为烧结容易沸腾。 将熔融的藻醇倒入试剂槽中，然后使用多通道移液器将 80 μL 的熔融藻醇排入 96 井微板的每口井中。允许板在室温下覆盖时治愈。将剩余的玫瑰在密封的袋子中冷藏长达一周，并重新熔化以制作额外的盘子。 2. 飞行分类和饥饿 通过将障碍条插入障碍条通道来准备耦合器。如果屏障条太松，则将它们绕在手指周围，使其曲率无法将它们保持在通道中。 把耦合器贴在饥饿板上。不要使用耦合器操纵板，因为耦合器可能会滑落。确保耦合器正确定位（即确保耦合器的角与微板的角度角匹配）。 在CO2 麻醉（材料表）下，排序3-5天老苍蝇。将单个苍蝇逐列装载到饥饿板中。注：虽然苍蝇按列加载，但建议将样品组分布在板的下行，而不是向下列（请参阅 图 4 以示板布局示例）。 通过将障碍条调整到封闭位置，在填充时关闭每个列。 图4：代表饥饿板布局。 该图显示了蒸发控制和雄性苍蝇在这项研究中使用的96井板的组织。还可使用替代配置，包括在 A 排和 H 排中具有蒸发控制的男性和女替行。 请单击此处查看此图的较大版本。 仔细记录微板内的示例布局。一旦饥饿板被填充，让苍蝇在去除CO2 后自发恢复，并饿死他们从最初的麻醉时间开始6小时。 3. 液体食品制备 注意：每天使液体食品新鲜。 在蒸馏 H2O 中准备 10 毫克/毫升的 FD&C Blue #1 染料库存溶液。注：可在室温下储存长达6个月。 在 15 mL 圆锥形管中，通过溶解 0.4 克蔗糖和 0.1 克酵母提取物（蒸馏 H 2 O. Vortex 管中溶解 0.4 克蔗糖和 0.1 克酵母提取物，将 10 mL 蒸馏 H2O. Vortex 管中溶解）中准备 10 mL 液体食品。10 mL 液体食品（1% 蔗糖、1% 酵母提取物、40 微克/mL FD+C Blue #1）。加入 40 μL 的染料库存溶液，并反复倒置管子以使溶液均质化。 将液体食品转移到一个10mL注射器倾斜与0.45μm过滤器。将溶液的 ±1.5 mL 一次过滤成 1.7 mL 微中心管。将包含溶液的注射器放在一边，并在进料板制备过程中根据需要过滤其他溶液。 4. 喂食板制备 注意：灌装后轻轻处理进料板，以防止在油井中形成气泡或液滴，这可能会影响吸附读数。 用密封膜密封 1536 井微板的底部，准备支线板。使用密封桨彻底粘附在薄膜上。用剃须刀刀片修剪左右边缘的多余薄膜。 将过滤后液体食品柱的 10 μL（见 图 5 以示示）分配到 1536 井微板的适当井中。每组四口井向左上侧井中分配（见 图5 图示）。 图5：为1536井支线板填写订单和井位置。 该图说明了协议的第 4.2 步。箭头显示从第 1 列到 12 列一次在进料板中引入馈送解决方案的顺序。示例 B1 被放大，以显示 1 选择和 2 选择测定的进给解决方案的位置示例。 请单击此处查看此图的较大版本。 一旦所有的油井都填满了，在盘子的顶部涂上密封膜。使用密封桨彻底粘附在薄膜上。用剃须刀刀片修剪左右边缘的多余薄膜。重复上述步骤，以获得所需的车牌数。 将板离心在 200 x g 10s 以沉积流体。不要让板被冷却，因为这会导致凝结积聚在井中，遮挡吸收读数。 5. 曝光 一旦苍蝇准备好进行食用检测，用装有直径为0.25毫米的针头的针头探针工具穿孔盘顶表面的井。使用与分配解决方案时相同的顺序穿孔。翻转盘子，打孔底部的井。擦去溶液之间的针头，以防止交叉污染。小心不要触摸穿孔，因为这会使井中的溶液变为芯。 在没有盖子的情况下，在 630 nm 下读取板的吸光度。 在顶部密封膜上放置一个内部盖子，以确保冷凝环包围穿孔井。将外部盖子放在盘子上。 将喂食板正面朝上放在耦合器上，以便导引对馈板和饥饿板的适当孔对齐。确保耦合器和板正确定位（即确保耦合器的角度角与板匹配）。将弹性带包裹在顶部和底部的板材上，将耦合器粘合在一起。检查进料板和耦合器之间的对齐和间隙。 一旦所有的进料板都装到耦合器上，通过调整耦合器上的屏障条来打开板的井。将耦合器/板组件放在辅助容器中。每个辅助容器最多可容纳六个组件。 将装有浸泡纸巾的移液器盒的下半部分放入每个次要容器中，以提供湿度。关闭次要容器的盖子，将其转移到受控环境中（25 °C，湿度控制，12h 光：暗循环）。允许苍蝇消耗22小时。 22 小时曝光后，检查每个板是否有死苍蝇，并相应地更新板布局。检查完所有盘子后，通过在辅助容器内泵送 CO2来对苍蝇进行集体麻醉。60 后，确保所有苍蝇都固定。轻轻地将苍蝇夹入饥饿板，并更换塑料屏障条。取出进料板以进行读取。 在 630 nm 重读板的吸光度。重复上述步骤，直到所有板都读完。 6. 数据分析 注：分析可以用调查员首选的软件包进行。 省略在22小时暴露期间死亡的苍蝇。 对于每口井，计算消耗的体积如下：C – 消耗量 （μL）V – 初始井体积（即 10 微升）ABS0 – 暴露前吸收ABS1 – 暴露后吸收注：在计算中，消费表示为正量。 要考虑蒸发，从各自板块内的苍蝇消耗值中减去平均蒸发量。对于 2 选择/首选测试，根据各自的解决方案调整每口油井，例如，通过蒸发控制中的”选择 1″调整”选择 1″井。 调整蒸发后，丢弃任何消耗值低于零的样品。 对于 2 选择测试，计算每个选项的首选项以及：P – 偏好指数（正方向表示偏好）FA – 含添加剂的液体食品消耗量（选项2）FN – 消耗的正常液体食品量（选项 1） 7. 微板和耦合器清洗协议。 注意：注意防止微板底部损坏，因为损坏会影响密封。 从 1536 井微板中取出薄膜和标签。将耦合器和屏障条分开。将屏障条放在密封容器中，如瓶子。通过在一系列温水、温和洗涤剂溶液、温自来水中大力摇晃来清洗屏障条，然后蒸馏 H2O。 在温暖的自来水下冲洗 1536 井微板和耦合器。对于微板，通过每个微板井运行自来水，以清除尽可能多的溶液和碎屑。如有必要，使用移液器尖端清除碎屑;不要在盘子上使用金属或玻璃器皿。 用温和的洗涤剂溶液（例如，1% v/v Aquet）覆盖每个盘子和耦合器。对于盘子，用戴手套的手擦洗表面。对于耦合器，使用刷子。 用自来水彻底冲洗每个盘子，然后用蒸馏的H2O。确保井在水流下经过专门冲洗。 让板材和耦合器在室温下干燥通风。存放在干净的存储箱中，直到使用。注意：切勿在没有手套的情况下处理 1536 井微板。皮肤残留的油会阻碍密封，导致油井泄漏和蒸发。