Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

1. Assemblage et utilisation du dispositif de transplantation Assemblage du dispositif de transplantation. Connectez la seringue étanche aux gaz Luer tip 25 μL et un porte-micropipette avec le raccord de verrouillage Luer pour assembler le dispositif de transplantation (Figure 1A).REMARQUE: Mouiller la pointe Luer avec un mince film d’eau peut aider à améliorer la connexion en maintenant les pièces ensemble via l’adhérence et la cohésion de l’eau. Montez le dispositif directement sur un micromanipulateur manuel (Figure 1B). L’appareil peut être contrôlé avec la main dominante seule, libérant l’autre main pour des tâches supplémentaires. Préparation de l’aiguille de transplantation. Produire une aiguille de transplantation en tirant une pipette capillaire en verre (sans filament) avec un extracteur de micropipette. Cassez le bout de l’aiguille aussi doucement que possible, car les arêtes vives augmentent le risque de rayer le jaune lors de la transplantation, ce qui est fatal à l’embryon.REMARQUE: La pointe peut être facilement cassée avec une lame de rasoir à bord droit sous un stéréomicroscope. Cependant, l’utilisation d’une microforge permet de générer une ouverture précise de la taille souhaitée. Pour la génération de sources ectopiques, un diamètre extérieur d’environ 50 à 60 μm est approprié. Pour les extirpations et la transplantation germinale, le diamètre extérieur de l’aiguille doit mesurer environ 80 à 90 μm pour augmenter le nombre de cellules transplantées. Insérez l’aiguille prête à l’emploi dans le dispositif de transplantation (Figure 1A). Utilisation du dispositif de transplantation.Placez le micromanipulateur avec le dispositif de transplantation à côté d’un stéréomicroscope (Figure 1B). Retirez le piston et abaissez l’aiguille de transplantation dans le plat de transplantation rempli de la solution de Ringer (voir étape 2.2.1) à un angle de 45° jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit immergée (Figure 1B). L’eau se précipitera vers le haut de l’aiguille en raison de l’action capillaire. Insérez le piston environ à mi-chemin pour rincer les solutions du Ringer, en ne laissant qu’un petit volume d’eau dans la partie mince et effilée de l’aiguille (Figure 1C).REMARQUE: C’est la position neutre, et le niveau d’eau devrait y être stable pendant un certain temps (>20 min). Si le niveau d’eau est instable, l’air fuit; reconnectez le raccord de verrouillage Luer ou remplacez la seringue. Lorsque vous utilisez une aiguille de transplantation pour la première fois, enduisez son intérieur en tirant le jaune d’un embryon sacrifié, puis en expulsant complètement le matériau du jaune. Le revêtement aidera à réduire l’adhérence des cellules au verre lors des procédures ultérieures. Positionnez doucement l’embryon donneur à l’aide de l’aiguille, puis positionnez l’aiguille orthogonale à la surface de l’embryon (Figure 1D).REMARQUE: La position sera différente pour différents tests. Pour la génération de sources de molécules de signalisation ectopique et les extirpations cellulaires, il s’agira du sommet du pôle animal (figure 1E); pour la transplantation germinale, ce sera la marge (Figure 1D,F). Tirez lentement et soigneusement le piston pour attirer les cellules dans l’aiguille.REMARQUE: Si les cellules sont absorbées trop rapidement, elles peuvent être endommagées. Si cela est fait correctement, les cellules devraient sortir sous forme de colonne cylindrique. Évitez de prendre du jaune dans l’aiguille, car le jaune transplanté est toxique pour l’embryon hôte. Arrêtez l’aspiration en poussant doucement le piston vers le bas une fois que le nombre souhaité de cellules est aspiré. Retirez l’aiguille de l’embryon en secouant l’aiguille sur le côté dans un mouvement court et rapide. Laissez une solution de Ringer de chaque côté de la colonne cellulaire et limitez les cellules à l’extrémité effilée de l’aiguille (Figure 1C,D).REMARQUE: Le liquide devant la colonne cellulaire aidera à séparer les cellules des embryons hôtes lors du dépôt de la colonne cellulaire. Éliminez tout jaune ou débris cellulaire restant en déplaçant lentement le piston de haut en bas – pendant que l’aiguille reste immergée – pour laver les cellules avec la solution de Ringer. Si cela est fait correctement, les cellules non endommagées resteront collées ensemble dans une colonne pendant que les débris sont emportés.REMARQUE: Il faut faire très attention pendant cette étape car le niveau de l’eau augmentera au-delà de l’extrémité effilée de l’aiguille. Cela provoquera un afflux soudain d’eau, qui peut être utilisée pour laver les cellules. Cependant, une fois que le niveau d’eau a dépassé l’extrémité effilée, le contrôle fin avec le piston sera réduit et le piston devra être déplacé plus lentement et plus soigneusement. Déplacez la boîte de transplantation avec la main non dominante pour positionner l’aiguille orthogonale à la surface (pôle ou marge de l’animal) de l’embryon hôte (figure 1D-F). Appliquez doucement une légère pression, puis donnez un mouvement rapide et brusque pour percer la couche enveloppante de l’embryon hôte. Veillez à ne pas rayer le jaune avec l’aiguille.REMARQUE: L’application d’une légère pression sur l’embryon en le pressant soigneusement contre les parois du puits augmente la tension superficielle de l’embryon et facilite ainsi le perçage de la couche enveloppante. Une fois l’aiguille à l’intérieur, poussez doucement le piston pour extruder la colonne de cellules dans l’embryon tout en rétractant lentement l’aiguille en même temps (Figure 1D-F). Nettoyage de l’aiguille de transplantation. Rincez l’aiguille en déplaçant le piston de haut en bas pendant que l’aiguille est immergée dans de l’eau désionisée.REMARQUE: Si l’aiguille reste sale, rincez-la avec une solution d’hydroxyde de sodium de 10 M avant de la rincer à nouveau à l’eau. Conservez l’aiguille dans une boîte appropriée pour une utilisation ultérieure. 2. Générer des sources ectopiques de molécules de signalisation sécrétées dans les embryons de poisson zèbre Préparation des embryons de l’hôte et du donneur. Recueillez des embryons fraîchement pondus en accoupleant le poisson-zèbre. Déchorionate des embryons de poisson-zèbre au stade 1cellule en incubant jusqu’à 100 embryons dans 0,5 mg/mL de solution de pronase pendant environ 15 min dans une petite boîte de Petri en verre (une description détaillée de cette procédure a été publiée par Rogers, K. W. et al.14).REMARQUE: Alternativement, les embryons peuvent également être déconionnés au stade élevé juste avant la transplantation (étape 2.2), mais cela nécessite que les embryons de donneur injectés et les embryons hôtes non injectés soient déconionnés séparément. Immerger les embryons dans un milieu embryonnaire dans un bécher de 200 ml.REMARQUE: Les embryons au stade de blastula et de gastrula décononnés sont très délicats. Leur jaune exposé adhère aux surfaces en plastique et se rompt au contact de l’air. Par conséquent, ils doivent rester complètement immergés dans un milieu embryonnaire, transférés avec une pipette en verre et maintenus dans des boîtes en plastique recouvertes d’agarose (1% dans un milieu embryonnaire) ou des boîtes de Petri en verre. Videz soigneusement la majeure partie du milieu embryonnaire et remplissez lentement le bécher avec du milieu embryonnaire frais. La légère agitation provoquée de cette façon facilitera l’élimination des chorions affaiblis. Répétez cette étape 2 à 3 fois. Transférer les embryons décononnés à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dans un récipient d’injection enrobé d’agarose.REMARQUE: Flamber la pointe de la pipette Pasteur en verre en l’exposant à une flamme de brûleur Bunsen peut fondre et lisser le bord, aidant à prévenir les dommages aux embryons. Injecter l’ARNm codant pour la protéine marquée par fluorescence dans un sous-ensemble d’embryons (une description détaillée de cette procédure a été publiée par Rogers, K. W. et al.14). Injectez l’ARNm dans la cellule, et non dans le jaune, pour une expression quasi homogène. Les embryons injectés serviront de donneurs, tandis que les embryons non injectés serviront d’hôtes.REMARQUE: La quantité et le type d’ARNm injectés dépendront de la molécule de signalisation étudiée et varient généralement de 20 à 200 pg2,4,5,6 (mais peuvent atteindre 1000 pg dans certains cas4). Transférer les embryons injectés dans un plat de six puits recouvert d’agarose rempli de milieu embryonnaire. Incuber à 28 °C jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade précoce de la sphère. Transplanter des cellules pour générer des sources ectopiques. Remplir une boîte de transplantation (avec des puits triangulaires individuels en forme de coin, voir tableau des matériaux) avec la solution de Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; stocker le tampon HEPES à 4 °C).REMARQUE: Le calcium dans la solution de Ringer favorise l’adhésion cellulaire et aide l’embryon à guérir de la procédure de transplantation. Transférez les embryons dans la boîte de transplantation. Positionner les embryons de l’hôte et du donneur dans des colonnes alternées, dans chaque cas avec le pôle animal orienté vers l’aiguille de transplantation. Effectuer la transplantation comme décrit à la rubrique 1.3. Pour la transplantation de source ectopique, prélever les cellules sources du haut du pôle animal et les déposer au même endroit dans l’embryon hôte (Figure 1E).REMARQUE: Le lavage des cellules avec la solution de Ringer comme détaillé à l’étape 1.3.8 est important pour la génération de sources ectopiques afin de s’assurer que les molécules de signalisation déjà sécrétées ne sont pas transférées à l’hôte. Ne transplantez pas trop de cellules pour vous assurer que la source n’est pas dispersée. Une colonne d’environ 80 μm de diamètre et 100 μm de longueur convient à de nombreuses applications. Laissez l’embryon hôte rester dans la solution de Ringer pendant 30 min à 1 h pour récupérer. Examiner si les cellules ont été transplantées avec succès à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence (Figure 2). Après la récupération, transférer les embryons dans une plaque de six puits recouverte d’agarose remplie de milieu embryonnaire et les incuber à 28 °C. 3. Génération d’embryons de taille réduite par extirpation cellulaire Préparation d’embryons en vue de leur disparition. Collectez des embryons fraîchement pondus de poissons-zèbres du génotype souhaité. Incuber les embryons à 28 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade élevé. Déchorionate les embryons comme décrit aux étapes 2.1.2-2.1.5 lorsque les embryons atteignent le stade supérieur.Remarque : Dans cet exemple, l’extirpation de cellule est effectuée au stade de la sphère. En conséquence, les embryons sont décholonnés environ 30 min à 1 h plus tôt. Facultatif : Étiquetage de la couche syncytiale de jaune (YSL).REMARQUE: Si vous le souhaitez, injectez du dextrans fluorescent dans le YSL avant d’extirper les cellules. Cette technique permet de déterminer si le YSL reste intact après l’ablation cellulaire, ce qui est important pour une embryogenèse normale15. Alternativement, des ARNm ou des protéines synthétisés in vitro peuvent également être injectés dans le YSL. Utilisez une pipette Pasteur pour transférer les embryons décchorionés dans un récipient d’injection enrobé d’agarose rempli d’eau embryonnaire. Orientez les embryons latéralement, la marge du blastoderme pointant vers l’aiguille d’injection (Figure 3A). Injecter 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran dans le YSL, en visant une région entre les cellules du blastoderme et le jaune à une profondeur d’environ un tiers du diamètre de l’embryon. Injecter tous les embryons dans une rangée.REMARQUE: Étant donné que l’aiguille d’injection n’a pas besoin de percer le chorion, une ouverture petite (~ 4 μm) et nette est avantageuse. Faites pivoter les embryons de 180° de sorte que le côté opposé de la marge du blastoderme pointe vers l’aiguille d’injection (Figure 3A). Injecter un autre 0,5 nL de 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran dans le YSL comme décrit à l’étape 3.2.3, ce qui donne un volume d’injection total de 1 nL par embryon.REMARQUE: L’injection de deux côtés permet une distribution plus uniforme du dextran fluorescent dans le YSL. Examinez le résultat de l’injection sous un stéréomicroscope à fluorescence. Si cela est fait correctement, le signal fluorescent sera limité à l’YSL (Figure 3B) et ne sera pas visible dans l’espace intercellulaire du blastoderme. Cellules disparues Remplissez un plat de transplantation avec la solution de Ringer (voir étape 2.2.1). Transférez les embryons dans le plat de transplantation. Orienter les embryons avec le pôle animal vers l’aiguille de transplantation (Figure 3C). Retirez soigneusement les cellules de la région du pôle animal comme décrit aux étapes 1.3.5-1.3.7, réduisant ainsi le blastoderme à la taille souhaitée. Jetez les cellules retirées en les expulsant de l’aiguille de transplantation. Une fois la procédure terminée, laissez les embryons rester dans la solution de Ringer pendant 30 min à 1 h pour récupérer. FACULTATIF : Examiner l’intégrité du YSL sous un stéréomicroscope à fluorescence (Figure 3D). Transférer les embryons dans une plaque recouverte d’agarose remplie de milieu embryonnaire et les incuber à 28 °C. 4. Création de mutants maternels-zygotiques par transplantation germinale Préparation des embryons d’hôtes et de donneurs. Recueillez des embryons fraîchement pondus de poissons-zèbres mutants et sauvages. Les embryons de poisson-zèbre avec un fond mutant serviront de donneurs, tandis que les embryons de poisson-zèbre avec un fond de type sauvage serviront d’hôtes.REMARQUE: La transplantation germinale nécessite un nombre élevé d’embryons de départ (~ 50 pour les donneurs, ~ 500 pour les hôtes) pour assurer un bon nombre de greffes germinales réussies qui survivent à l’âge adulte. Transférer les embryons dans une boîte d’injection enrobée d’agarose avec un milieu embryonnaire à l’aide d’une pipette Pasteur.REMARQUE: Les injections sont effectuées avant la déschorionation pour augmenter le débit. Les aiguilles pour injection à travers le chorion doivent être émoussées et avoir une plus grande ouverture (~ 10 μm) pour éviter le colmatage. Injecter aux embryons donneurs 1 nL de 100 ng/μL d’ARNm codant pour GFP avec un UTR nos1 3′. Injectez l’ARNm dans le jaune pour augmenter le débit.REMARQUE: Le nos1 3’UTR stabilisera l’ARNm dans les cellules germinales primordiales, ce qui rendra les cellules germinales fortement fluorescentes lorsqu’elles sont imagées 1 jour après la fécondation10. Injecter aux embryons hôtes 1 nL de morpholino sans issue (dnd) de 0,33 mM (3 μg/μL). Injectez le morpholino dans le jaune pour augmenter le débit.REMARQUE: Le morpholino dnd bloque la formation de cellules germinales primordiales, ce qui garantit que la lignée germinale de l’embryon hôte sera exclusivement peuplée de cellules du donneur après la transplantation10. Transférer les embryons injectés dans des boîtes de Petri en plastique avec un milieu embryonnaire. Incuber à 28 °C jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade élevé. Déchorionate les embryons comme décrit aux étapes 2.1.2-2.1.5 lorsque les embryons atteignent le stade supérieur. Transplantation de cellules germinales Remplissez un plat de transplantation avec la solution de Ringer (voir étape 2.2.1). Transférer les embryons de sphère décoronés au stade du dôme dans la boîte de transplantation. Positionnez les embryons hôtes et les embryons de donneurs dans des colonnes alternées pour transplanter les cellules d’un embryon donneur à six embryons hôtes différents. Cela augmente les chances que les cellules germinales d’un embryon hôte donné soient transplantées avec succès. Orienter les embryons avec la marge vers l’aiguille de transplantation et effectuer la transplantation comme décrit à la section 1.3. Pour les transplantations germinales (Figure 1D,F), prélevez les cellules sources de la marge (où se trouvent les cellules germinales primordiales) et déposez-les au même endroit dans l’embryon hôte.REMARQUE: La transplantation d’une grande colonne (environ 80 μm de diamètre et 600 μm de longueur) augmentera les chances d’obtenir une greffe germinale réussie. Laisser l’embryon rester dans la solution de Ringer pendant 30 min à 1 h pour récupérer une fois la transplantation terminée.REMARQUE: Si tous les embryons de donneurs ne sont pas censés être des mutants homozygotes – par exemple, s’ils résultent d’un croisement hétérozygote – ils doivent être génotypés après la transplantation pour déterminer le génotype de la future lignée germinale transplantée de l’hôte. Dans ce cas, assurez-vous que les positions des embryons de l’hôte et du donneur ne sont pas mélangées lors de la manipulation. Utilisez un stéréomicroscope à fluorescence pour examiner si les cellules ont été transplantées avec succès (Figure 4A,B). Transférer les embryons dans une plaque recouverte d’agarose de 24 puits. Regroupez tous les embryons hôtes qui ont reçu des cellules du même donneur dans le même puits et étiquetez-les en conséquence. Incubés jusqu’au lendemain à 28 °C. Si nécessaire, transférez les embryons du donneur dans des bandelettes PCR étiquetées pour le génotypage. Dépistage des greffes germinales réussies Dépister les embryons hôtes pour des greffes germinales réussies sous un stéréomicroscope à fluorescence environ 30 h après la fécondation (HPF). Les cellules germinales se trouvent au niveau de la rainure au-dessus de l’extension du jaune (Figure 4C).REMARQUE: Les expériences typiques avec le dispositif et la stratégie présentés ici auront un taux de réussite d’environ 60% à 80% pour obtenir au moins un embryon hôte portant des cellules germinales transplantées par embryon donneur. Un rapport précédent décrivait une efficacité d’environ 10 . S’il y a lieu, jeter les embryons qui ont reçu des cellules d’embryons de donneurs avec un génotype incorrect. Cultiver des larves avec des cellules germinales transplantées avec succès à l’âge adulte selon les conditions d’élevage standard et en suivant les directives institutionnelles.