일방적 인 신장 허혈 - 재관류 손상의 효과적인 마우스 모델

다음 프로토콜은 생존 수술을 설명합니다. 따라서 가장 높은 무균 및 외과 적 관행이 적용됩니다. 모든 동물 실험은 제도적 지침에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. IRI 효과의 성별 및 균주 기반 차이를 제거하기 위해 수컷 C57BL6 마우스 만 연구에 사용되었습니다. 모든 동물은 나이와 체중을 매칭하여 비교 가능한 결과를 생성하였다. 1. 준비 참고: 서로 다른 실험 단계 및 개입의 타임라인은 그림 1A에 나와 있습니다. 각 절차 전에 수술 테이블을 청소하고 소독하십시오. 필요한 모든 재료(멸균 도구 및 면봉, 멸균 거즈 및 커튼, 미리 희석된 마취제, 가열 패드, 멸균된 혈관 클램프, 멸균 식염수, 피부 소독제 및 봉합사)를 수술 테이블에 준비하고 놓습니다( 재료 표 참조). 수컷 C57BL6 마우스 (연령 범위 11-13 주)를 케타민 / 자일라진 (각각 100 mg / kg 및 20 mg / kg의 체중, 이전에 멸균 식염수로 희석)의 복강 주사로 마취하십시오.참고 : 스트레스 반응이 마취제의 작용에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로 숙련 된 동물 취급은 동물의 스트레스를 최소화하는 데 필수적입니다. 케타민 / 자일라진 투여 후 면도날과 비누를 사용하여 오른쪽 측면의 수술 부위를 면도하십시오.참고 : 피부를 면도하면 상처 치유뿐만 아니라 생존 수술의 일반적인 결과가 향상됩니다. 수술 부위의 피부를 먼저 70 % 알코올로 소독 한 다음 면봉을 사용하여 포비돈 요오드 용액으로 소독하십시오. 피부 준비 후, 마우스를 복부 욕창 위치의 가열 테이블 위에 놓고 37°C에서 체온을 안정화시킨다(직장 및 패드 센서 프로브를 통해 모니터링).참고 : 신장은 측면보다는 복부 욕창구에 놓일 때 더 쉽게 접근하고 외과 적으로 노출됩니다. 체온이 안정되는 동안 마우스의 눈에 눈 연고를 바르십시오.참고 : 케타민과 같은 해리 마취제는 마취 중에 동물의 눈을 뜨게합니다. 2. 수술 통증 반사가 없으면 (핀셋으로 발가락을 꼬집는 발가락), 메스 블레이드를 사용하여 오른쪽 측면에서 약 1cm 등쪽 측면 절개를 수행하십시오. 마지막 갈비뼈 뒤의 절개를 시작하고 요추 정중선과 평행하게 약 1cm를 계속 진행하십시오. 복막 공간을 시각화하기 위해 가위를 사용하여 복부 근육 조직을 횡단하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 근육을 절개하는 동안 생성 된 소량의 혈액을 제거하십시오.참고: 등쪽 측면 접근법이 사용되기 때문에 복강이 아닌 후복막이 이 절차를 통해 접근됩니다. 오른쪽 신장을 복강에서 밀어 내십시오. Graefe 포셉을 사용하여 신장을 조심스럽게 노출시킵니다.참고 : 복부에 놓을 때 신장에 외상성 손상을 피하기 위해 포셉을 항상 닫아 두고, 신장을 외과 절개 및 밖으로 조심스럽게 밀고 안내하는 데에만 사용하십시오. 천천히 오른쪽 신장을 노출하고 신장 소아를 확인하십시오. 조심스럽게 소아 주위의 지방 조직을 제거하십시오. 허혈을 유도하려면 신장 소아에 존재하는 신장 동맥과 정맥 위에 혈관 클램프를 놓고 인접한 요관을 클램핑하지 마십시오. 혈관 클램프를 조작하기 위해 Halsted-Mosquito 지혈제를 사용하십시오.참고: 허혈은 신장의 색이 적색 분홍색에서 진한 보라색으로 변하는 것을 시각화하여 확인할 수 있습니다(그림 1B). 건조를 피하기 위해 식염수에 담근 멸균 거즈로 클램핑 된 신장을 덮고 30 분 동안 그대로 두십시오. 이 시간 동안 정기적으로 거즈의 마취 깊이와 습도를 모니터링하십시오.주: 마취의 유도 용량은 허혈성 사건이 끝날 때까지 진통제를 제공하기에 충분하다; 따라서 추가 마취 주사가 필요하지 않습니다. 허혈 기간이 끝나기 직전에 거즈를 제거하고 신장을 발견하십시오. Halsted-Mosquito 지혈제를 잡고 클램프 제거 준비를하십시오. 분 30에서 지혈제로 혈관 클램프를 열고 신장 페디클에서 제거하여 신장의 재관류를 허용합니다.참고: 재관류는 신장의 색이 짙은 보라색에서 적색-분홍색으로 변하는 것을 시각화하여 확인할 수 있습니다(그림 1C). 신장 페디클을 클램핑하지 않고 가짜 동물에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 수행하십시오. 신장 색 변화를 확인한 후 신장을 복강으로 되돌립니다. 십자형 패턴을 사용하여 흡수 가능한 봉합사 5-0으로 복부 근육을 닫습니다.참고 : 근육과 피부를 봉합하는 동안 진통제를 유지하기 위해 마취제의 두 번째 주사가 필요할 수 있습니다. 초기 복용량의 절반은 수술이 끝날 때까지 진통제를 제공하는 데 효과적임이 입증되었습니다. 수평 매트리스 패턴을 사용하여 흡수 가능한 봉합사 5-0으로 피부를 닫습니다. 면봉을 사용하여 포비돈 요오드 용액으로 상처를 닦으십시오. 3. 회복 및 수술 후 참고 : 수술 후 시간은 실제 재관류 시간이므로 적절한 수술 후 치료는 윤리적으로 필수적이며 과학적으로 관련이 있습니다. 재관류 시간은 연구자에 의해 요구되는 바에 따라 선택될 수 있다. 4 h, 8 h, 16 h, 1 일, 2 일, 4 일, 및 7 일의 재관류 시간을 비교하여 신장 IRI에 의해 유도되는 병리학 적 변화의 순차적 개요를 얻는다. 마우스가 마취에서 회복되기 시작할 때까지 가열 패드에 보관하십시오.참고: 마우스가 다리를 움직이기 시작하고 움직이려고 시도할 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 수술 중에 추가 마취 주사가 필요한 경우 회복 시간이 길어집니다. 알파-2 수용체 길항제인 아티파메졸은 자일라진 효과를 역전시키고 회복 단계를 단축하기 위해 복강내 체중 0.5mg/kg의 용량으로 투여할 수 있습니다. 통증 관리를 위해 buprenorphine (체중 0.1 mg / kg, 복강 내)은 수술 전 및 회복 및 수술 후 단계에서 6 시간마다 투여됩니다. 비 스테로이드 성 항염증제의 사용은이 가족의 여러 약물이 신 독성을 유발하므로 결과를 바꿀 수 있으므로 권장하지 않습니다. 마취에서 회복 한 후, 마우스를 물과 음식에 자유롭게 접근 할 수있는 새장에 다시 넣으십시오.참고 : 으깬 음식은 페트리 접시뿐만 아니라 숨기고 놀기위한 재료 (예 : 종이 시트, 종이 타월 튜브)로 제공 될 수 있습니다. 매일 마우스를 모니터링하여 상처 치유, 음식 및 물 섭취량, 체중 및 행동을 평가하십시오.참고: 상처 치유 상태는 다음의 척도를 사용하여 평가되었다: 1, 건조; 2, 젖은; 3, 부분적으로 열린; 4, 열었습니다. 빠른 상처 치유는이 연구에서 문서화되었으며, 2 일째 후에 건조한 상처의 90 % 이상이 문서화되었습니다. 4. 안락사 및 샘플 수집 마우스의 마취 용량의 두 배인 용량으로 복강내 투여된 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 안락사시킨다(100 mg/kg). 필요에 따라 유체 및 조직 샘플을 수집합니다.참고 : 신장, 전혈 (혈구 수), 혈청 (혈액 생화학 용), 소변, 심장 및 폐를 모두 수집했습니다. 혈액 생화학 분석 (혈액 요소 질소 (BUN), 크레아티닌, 전해질)을 위해 몇 마이크로 리터의 혈청이 필요합니다. 필요한 경우, 안락사 24 시간 전에, 마우스는 신장 기능 매개 변수의 결정을 허용하는 더 높은 소변 부피를 수집하기 위해 대사 케이지에 배치 될 수있다.