大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

1. 実験設計と植物栽培 注:実験仮説に応じて実験を設定すると、例えば、大規模なGWAS母集団を使用すると、アクセッションの代わりにすべての個々のSNPのハプロタイプに基づいて統計的検定が行われるため、複数の反復の必要性が減少します。対照的に、複数の反復は他の実験的アプローチでは不可欠です。実験の準備にあたっては、以下の点を考慮する必要があります。 実験仮説に応じて、十分な生物学的複製を含める。 生物学的複製物をブロック単位でランダム化して、栽培中の局所的な環境バイアス、例えば温室、畑を減少させる。 成長中の植物の適切なメンテナンスを確保します。植物を均質に処理してバイアスを軽減します。 2. 生物植物材料の調製 収穫準備 均質化のための2つの5mmおよび2つの8mm直径金属ビーズを含むラベル収穫チューブ(20mL)。デュワーを液体窒素で満たします。注:植物は、新鮮な葉と根の組織収穫のための栄養段階にあるべきです。 液体窒素中でのフラッシュ凍結により生体試料を採取する。収穫期間の延長中の代謝に対する概日振動の影響を排除するために、できるだけ早く収穫する12、13。収穫した新鮮な葉および根組織を-80°Cでさらに処理するために保管する。注:葉の切断からフラッシュ凍結までは、葉の切断後、活発な生物学的プロセスが創傷のために代謝プロファイルを変化させるため、数秒以上かかるべきではありません。根の場合は、液体窒素でフラッシュ凍結する前に水洗して根をきれいにしてください。根の表面の余分な水は、紙のティッシュで浸す必要があります。乾燥した種子は室温で保存することができます。液体窒素中の凍結は必要ありません。 ティッシュミキサーミルを用いて組織を粉砕する。 チューブホルダーを液体窒素で数分間予冷し、組織を粉砕しながら低温を維持します。 -80°Cの冷凍庫から取り出した後、窒素含有デュワーで生体試料を輸送する。 均質な粉末を得るために組織を粉砕する;25Hzを1分間使用し、組織が均質に粉砕されていない場合は液体窒素で凍結した後に繰り返します。 乾燥した種子を粉砕するには、直径15mmの金属ビーズを入れた粉砕瓶に種子を入れます。2.3.3 で説明したのと同じ頻度と時間を使用してください。注:ティッシュミキサーミルが利用できない場合は、清潔で予冷された乳鉢と乳棒を使用できます。 プリクールラベル付き2 mLセーフロック微量遠心チューブ。分析スケールを使用して、50mgの新鮮な植物材料の誤差±5mgの重量を量る。液体窒素中の植物材料を移送するために使用されるツールを予冷する。計量プロセス中に植物材料が凍結したままであることを確認してください。注:温度の上昇によって生物学的プロセスが活性化され、代謝プロファイルが変化するため、新鮮な植物材料を室温に長時間さらさないでください14。 各サンプルの割合をプールし、プールされた新鮮な植物材料の誤差±5 mgで50 mgの重量を予冷された2 mLのセーフロック微量遠心チューブにプールすることによって、追加の品質管理(QC)サンプルを生成します。注: 60 サンプルごとに少なくとも 3 つの QC サンプルをお勧めします。QC サンプルは、下流の補正、正規化、および分析に不可欠です。 抽出試薬 新鮮な組織、例えば、葉や根メモ: サンプル抽出は、前述のプロトコル15 に基づいています。このプロトコルは、現在のニーズ、例えば、複数の組織、異なる内部標準、および大規模な実験に基づいて修正されている。さらに、下記のすべてのボリュームと機器の設定は、社内の分析ユニットに合わせて調整されます。プロトコルユーザーは、試験サンプルに基づいて、分析ユニットと生物学的サンプルに応じてこれらを調整する必要があります。 抽出混合物1(EM1):メチル tert-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール(MeOH)(3:1 v/v) MTBE/MeOHを3:1の比率で混合して調製する。100 mL の抽出溶媒の場合、75 mL の MTBE と 25 mL の MeOH を清潔なガラス瓶に混ぜます。注:溶剤は、適切な安全装置を使用してヒュームフード内で慎重に取り扱う必要があります。 UHPLC-MSベースの脂質分析の内部標準として45 μLの1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(クロロホルム中1 mg/mL)、GC-MSベースの分析のための内部標準として400 μLのリビトール(水中1 mg/mL)、およびUHPLC-MSベースの代謝産物分析のための125 μLのイソビテキシン(MeOH/水中(1:1 v/v)1 mg/mL)を加える。注: 分析ニーズに応じた分析後の正規化には、内部標準の追加が必要です。各サンプルに1mLのEM1が必要なので、実験サンプルサイズに応じて原液を調製し、実験全体に使用する必要があります。EM1は-20°Cで保管する必要があります。 使用された内部標準がなく、調査対象種の他の化合物と重複していないか確認してください。いくつかの標準を使用できます。このプロトコルにおける内部標準物質の選択は、共通豆抽出物16を用いた以前の試験に基づいていた。 抽出混合物 2 (EM2) 水/メタノール (MeOH) (3:1 v/v) 100 mL EM2 の場合は、清潔なガラス瓶に 75 mL の二重蒸留水と 25 mL の MeOH を加えます。 サンプルあたり500 μLのEM2を添加し、実験サンプルサイズに応じて原液を調製し、実験全体に使用する必要があります。EM2を4°Cで保管してください。 乾燥種子 抽出混合物 3 (EM3) メタノール (MeOH)/ 水 (7:3 v/v) 100 mL の EM3 の場合は、70 mL の MeOH と 30 mL の二重蒸留水を清潔なガラス瓶に入れます。各サンプルに対して1mLのEM3を調製する。 GC-MSベースの分析では400 μLのリビトール(水中1 mg/mL)を、UHPLC-MSベースの代謝産物分析には125 μLのイソビテキシン(MeOH/水中で1 mg/mL(1:1 v/v))を加えます。注:実験サンプルサイズに応じて原液を調製し、実験全体に使用してください。EM3を4°Cで保管してください。 4. サンプル抽出 新鮮な組織、例えば、葉や根 各サンプルに対して3本の1.5 mLセーフロック微量遠心チューブを用意します。EM1を-20°Cの液体冷却システムに保管してください。新鮮なサンプルを-80°Cの冷凍庫からドライアイスまたは液体窒素に移して輸送します。氷上を保つ前に、予冷EM1を各50mgアリコートおよびボルテックスに1mL加える。 サンプルを800 × g のオービタルシェーカー上で4°Cで10分間インキュベートします。 氷冷超音波処理浴中でサンプルを10分間超音波処理する。 マルチチャンネルピペットを使用して500 μLのEM2を添加し、追加容量の変動を回避します。 試料を短時間ボルテックスし、抽出混合物を混合してから、11,200× g で4°Cで5分間遠心分離する。 相分離が生じた後、上部脂質含有相の500 μLを予め標識された1.5 mLのセーフロック微量遠心チューブに移す。上段のフェーズの残りの部分を削除します。注:この上相は蒸気圧が高く、ピペットから漏れる傾向があるため、転送中は注意してください。 GC-MS および UHPLC-MS 分析に使用した 2 本の 1.5 mL セーフロック微量遠心チューブに、下極性および半極性代謝産物含有相の 150 μL および 300 μL をそれぞれ移します。 真空濃縮器を用いて加熱せずに溶媒を蒸発させて抽出した画分を全て濃縮し、-80°Cで保存する。 乾燥種子 各サンプルに対して2本の1.5 mLセーフロック微量遠心チューブを用意します。EM3を氷上に保ちます。直径5mmの金属ビーズをサンプルアリコートに入れます。 各50mgアリコートに1mLのEM3を加え、サンプルを25Hzで2〜3分間ホモジナイズしてから氷上に置く。 氷冷超音波処理浴中でサンプルを10分間超音波処理する。 11,200 × g で4°Cで5分間遠心分離する前にサンプルを短時間ボルテックスします。 GC-MS および UHPLC-MS 分析に使用した 2 本の 1.5 mL セーフロック微量遠心チューブに、上清 150 μL と 300 μL をそれぞれ移します。 真空濃縮器を用いて加熱せずに溶媒を蒸発させて抽出した画分を全て濃縮し、-80°Cで保存する。注:経験に基づいて、ユーザーは乾燥種子中の半極性代謝産物および誘導体化代謝産物分析についてステップ4.2を実行することをお勧めします。乾燥種子脂質分析のための抽出ステップ4.1を実行する。 5. UHPLC-MSを用いた脂質の分析 乾燥した脂質画分を250μLのアセトニトリル:2-プロパノール(7:3、vol/vol)に再懸濁する。 脂質相を5分間超音波処理し、11,200 × g で1分間遠心分離する。 上清90 μLをLC-MS用のガラスバイアルに移す。 2 μLの抽出物をLC-MSに注入する。 表1に示すように、溶離液AとBを徐々に変化させながら、400 μL/minのフローで60°Cに保持した逆相C8カラムで脂質分画を行います。質量範囲150~1,500m/zの正イオン化モードで質量スペクトルを取得します。 すべての毎日のバッチにいくつかのQCサンプルとブランクを含めて、分析変動の補正を確実にします。サンプルをブロック単位で順番にランダム化します。 6. UHPLC-MSを用いた極性および半極性代謝産物の解析 乾燥した極性相を180μLのUHPLCグレードメタノール:水(1:1 v/v)に再懸濁します。 極性相を2分間超音波処理し、11,200 × g で1分間遠心分離する。 上清90 μLをLC-MS用のガラスバイアルに移す。 3 μLの抽出物をLC-MSに注入する。 表 1 に示すように、溶離液 A と B を徐々に変化させながら、400 μL/minのフローで 40 °C に保持した逆相 C 18 カラムで代謝産物分画を実行します。フルMSスキャンで100~1,500m /z の質量範囲の質量スペクトルを取得し、40keVの高エネルギー衝突解離(HCD)によって誘導されるすべてのイオンフラグメンテーション(AIF)を取得します。メモ: 両方のイオン化モードを使用します。ただし、多数のサンプルを実行している間は容量が限られているため、両方のイオン化モードでテストサンプルを実行して、好ましいイオン化モードを決定します。 すべての毎日のバッチにいくつかのQCサンプルとブランクを含めて、分析変動の補正を確実にします。サンプルをブロック単位で順番にランダム化します。 データ依存 MS2 でプールされた QC を負イオン化モードと正イオン化モードの両方で実行します。後のステップ(8.5)で得られた質量スペクトルを注釈に使用します。 GC-MSを用いた誘導体化代謝産物の解析17,18 注:誘導体化代謝産物の分析は、前述のプロトコル17に基づいています。すべての誘導体化試薬をヒュームフードで取り扱います。 N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオラセタミド(MSTFA)が水や湿度と接触しないようにしてください。 誘導体化試薬1(DR1) メトキシアミン塩酸塩をピリジンに溶解し、30mg/mLの濃度のDR1を得た。各サンプルに 40 μL の DR1 を使用してください。サンプルサイズに応じて原液を調製し、室温で保存した。 誘導体化試薬2(DR2) MSTFAをMSTFA1mLあたり20μLの脂肪酸メチルエステル(FAME)で溶解する。各サンプルに 70 μL の DR2 を使用します。サンプルサイズに応じて原液を調製する。MSTFA を 4 °C、FAME を -20 °C で保存します。注:FAMEには、メチルカプリル酸、メチルペラルゴン酸メチル、メチルカプリン酸、ラウリン酸メチル、メチルミリスチン酸メチル、メチルパルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、メチルエイコサン酸、メチルドコサノエート、リグノセリン酸メチルエステル、メチルヘキサコサノエート、メチルオクタコサノエート、トリアコンタン酸メチルエステルが含まれ、これらはそれぞれ液体または固体標準で0.8μL/mLまたは0.4mg/mLの濃度でCHCl3に溶解される。 真空濃縮器を使用して極性相(-80°Cで保存)からペレットを30分間再乾燥し、貯蔵中に発生するH2Oと下流の誘導体化に使用される溶媒との干渉を回避します。 40 μL の DR1 を追加します。 オービタルシェーカーを用いてサンプルを950 × g で37°Cで2時間振とうし、続いて液体を短時間スピンダウンした。 70 μL の DR2 を追加します。 オービタルシェーカーを用いて37°Cで30分間、950× g で再度振とうする。 GC-MS分析のために90 μLをガラスバイアルに移す前に、室温で短時間遠心分離する。 代謝産物濃度に応じて、2 mL/minの一定のヘリウムキャリアガス流でGC-MSスプリットレスモードに1 μLを注入します。注入温度は、30mのMDN-35キャピラリーカラムを用いて230°Cに設定する。メモ: 温度勾配などの追加情報については、 表 1 を参照してください。質量範囲は、20スキャン/分で70-600 m/zに設定されています。推定過負荷化合物の定量化を可能にするスプリットモードを含め、そのような場合の抽出物再誘導体化のコストと時間を節約します。 すべての毎日のバッチにいくつかのQCサンプルとブランクを含めて、分析変動の補正を確実にします。サンプルをブロック単位で順番に適切にランダム化します。 8. クロマトグラム処理と複合アノテーション 強度閾値を定義することにより、化学ノイズをフィルタリングします。クロマトグラムの処理中にすべてのQCサンプルを含めます。メモ: 大規模なデータの場合、ノイズフィルタリングは計算時間と処理能力を減らすために重要です。 クロマトグラムを揃えるには、保持時間シフトウィンドウを定義します。各バッチのクロマトグラムをチェックして、バッチ内およびバッチ間の変動を評価します。 ピーク形状に応じてピーク検出を行い、例えば、半値全幅(FWHM)計算の高さと幅。 同位体をクラスタ化して冗長信号を減らし、シングルトンをフィルタリングします。注:クロマトグラム処理に使用されるソフトウェアの詳細については、材料表を参照してください。MS-DIAL、MetAlign、MzMine、Xcalibur 19、20、21など、自由に利用可能なさまざまなソフトウェアツールを使用してクロマトグラムを処理する方法に関する詳細なプロトコルが提供されています。 複合アノテーションには、プールされた QC サンプルの ddMS2 データを使用します。モノアイソトピック質量を決定し、一般的な中性損失、既知の荷電アグリコン、および異なるタイプの切断(例えば、ホモリティックまたはヘテロ分解)を観察することによって、分子構造を評価する16,22。 代謝産物データの報告については、Fernie et al. 201123に記載されている勧告に従ってください。注:異なる計算メタボロミクスアプローチを使用して、メタボロミクスデータ24、25、26を分析することができる。 9. 大規模メタボロミクスデータセットの正規化 内部標準の分布を確認し、単一または複数の内部標準の応答を補正して正規化します。 クロマトグラムから得られたピーク強度を、ステップ2.5から小分けされた均質化サンプル重量で割ることによって、正確なサンプル重量にわたって補正します。 マルチバッチシリーズ全体の強度ドリフトを補正します。Rを使用して、局所推定散布図平滑法(LOESS)27などのQCベースの補正方法を実行します。注:バッチ28,29全体の取得中のMS性能のドリフトに対処するために、いくつかのツールとパッケージが利用可能です。 GWASを実行するためのRパッケージMASSからのboxcox()関数を使用するデータ変換、例えば、ボックスーコックス変換30によって形質の正規分布を保証する。 多変量解析のためにデータスケーリング、例えばパレートスケーリングを実行して、低存在量化合物31の適切な計量を確実にする。注:可能であれば、マトリックス効果を回避するために回収アッセイ(例えば、イオン抑制14)を実行します。 10. ゲノムワイド関連研究(GWAS)32 一塩基多型(SNP)または構造変異体(SV)を配列決定データ33、34から呼び出す。 Tassel35を使用して、低周波バイアスを避けるために、マイナー対立遺伝子頻度(MAF)10%の遺伝子型データをフィルタリングします。 R パッケージ Ime436 を使用して、実験の繰り返しで正規化された各フィーチャの最適な線形不偏予測 (BLUP) を計算し、環境要因 (ランダム効果) に起因するバイアスを排除します。 R37 の rMVP パッケージを使用して GWAS を実行するには、各機能の BLUP を個別に使用します。注:各メタボロミクスの特徴は、ここでは個々のスタンドアロン表現型として見なされます。 GWASの実行中は、交絡効果を最小限に抑えるために、主成分分析(PCA)と状態別同一性(IBS)またはvanRadenを使用して集団構造を修正します。さらに、混合モデルには固定効果とランダム効果が含まれているため、混合線型モデル(MLM)または多軌跡混合モデル(MLMM)の使用を検討してください。 11. QTL 検出 マンハッタンプロットを考慮に入れて、有意な関連性を示すSNPをチェックして、連鎖不平衡(LD)計算を行い、基礎となる遺伝子領域を決定します。R パッケージ LD ヒートマップ またはタッセル 5 を使用して LD 計算を実行します。 ハプロタイプ間の統計的変化の形質レベルを調べて、潜在的な因果的SNP、例えば、表現型変動を説明できるタンパク質コード配列のアミノ酸変化をもたらすSNPsを見つけることによって、関連するSNPsの特性に対する効果サイズをチェックする。注:SNP形質の関連は必ずしも因果関係をもたらすとは限らないため、ゲノム領域を決定することが重要です。特徴アノテーションによる化合物同一性は、特定のゲノム領域において適切な候補遺伝子を見つけるのに非常に役立ちます。我々は、図4に示すように、多面的マップ内の特定の化合物に関連するすべての検出されたQTLを組み合わせて、遺伝的領域38に下線を引くことを提案する。候補遺伝子の検証のために、いくつかのアプローチを行うことができる(議論を参照)。