Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging
Summary
Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state tradizionalmente studiate per le loro proprietà rigenerative, ma più recentemente, le loro caratteristiche immunoregolatrici sono state in prima linea. Interagiscono e regolano l’attività delle cellule immunitarie. Il focus di questo studio è la regolazione MSC dell’attività fagocitica dei macrofagi. La fagocitosi dei macrofagi (MΦ) è una parte importante della risposta del sistema immunitario innato alle infezioni e i meccanismi attraverso i quali MSC modula questa risposta sono in fase di studio attivo. Qui viene presentato un metodo per studiare la fagocitosi MΦ di particelle di zimosan non opsonizzate coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH mentre sono in co-coltura con MSC. Man mano che l’attività fagocitica aumenta e le particelle di zimosane etichettate sono racchiuse nell’ambiente acido del fagolisiosoma, aumenta l’intensità di fluorescenza della molecola sensibile al pH. Con le opportune lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione, l’attività fagocitica viene misurata utilizzando uno spettrofotometro fluorescente e i dati cinetici vengono presentati come cambiamenti nelle unità fluorescenti relative per un periodo di 70 minuti. Per supportare questi dati quantitativi, il cambiamento nell’attività fagocitica viene visualizzato utilizzando l’imaging dinamico. I risultati che utilizzano questo metodo dimostrano che quando in co-coltura, MSC migliora la fagocitosi MΦ dello zimosan non opsonizzato di MΦ trattato sia naïve che IFN-γ. Questi dati si aggiungono alle attuali conoscenze sulla regolazione MSC del sistema immunitario innato. Questo metodo può essere applicato in indagini future per delineare completamente i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule progenitrici che danno origine a cellule del tessuto connettivo. Le MSC sono presenti nei tessuti dei mammiferi adulti e possono essere isolate dal midollo osseo1. A causa delle loro proprietà immunomodulatorie, queste cellule sono ampiamente studiate2. I primi studi si sono concentrati sulla regolazione MSC delle cellule T3,4,5,6 ma più recentemente, la loro regolazione delle cellule macrofagiche (MΦ), una delle principali componenti cellulari dell’immunità innata, ha ricevuto maggiore attenzione7,8,9,10,11,12,13,14 . L’importanza dell’interazione MSC-MΦ nel trattamento della malattia infiammatoria è sottolineata dal fatto che l’esaurimento dei monociti/macrofagi abroga gli effetti terapeutici della MSC nei modelli animali8. Qui, il focus è l’interazione di contatto cellulare dell’MSC con MΦ. MSC hanno la capacità di regolare il fenotipo di MΦ promuovendo il passaggio da risposte infiammatorie a anti-infiammatorie, portando ad attività di riparazione tissutale8,9,10,11, e molto è stato fatto per dimostrare questi meccanismi regolatori. In altre circostanze, MSC può supportare o esacerbare una risposta infiammatoria guidata da MΦ12,13 e migliorare l’attività fagocitica MΦ14,15. Tuttavia, vi è una mancanza critica di dati esistenti che identifichino i meccanismi e le condizioni in cui MSC regola l’attività fagocitica di MΦ.
MΦ hanno famiglie di recettori che riconoscono patogeni opsonizzati (anticorpi o complementi rivestiti) o non opsonizzati che portano alla fagocitosi16. L’attivazione e l’attività di quest’ultimo è meno ben studiata17. In un ambiente non infiammatorio in vitro, MSC migliora la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati13. Tuttavia, il riconoscimento di patogeni non opsonizzati da parte di MΦ può essere ridotto dopo l’esposizione a un ambiente infiammatorio prodotto dai linfociti durante una risposta immunitaria adattativa. IFN-γ, rilasciato da cellule natural killer e linfociti effettori, ha un effetto inibitorio sulla fagocitosi MΦ di particelle non opsonizzate18. È stato sviluppato un modello di co-coltura per studiare i meccanismi di regolazione del contatto diretto MSC della fagocitosi MΦ. L’obiettivo dell’esperimento qui presentato è determinare se MSC regola la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati dopo che MΦ è stato esposto a IFN-γ (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi della fagocitosi utilizzando bioparticelle coniugate ad un colorante sensibile al pH è uno strumento relativamente nuovo che si è dimostrato vantaggioso rispetto alle tradizionali particelle etichettate fluorescentmente12,19,20. Con le tradizionali particelle etichettate fluorescenti, è possibile solo l’analisi del punto finale. La rilevazione viene effettuata con microscopia fluorescente e/o spettrofluorometria dop…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal meccanismo NSF Major Research Instrument nell’ambito dei numeri di sovvenzione 1626093 e 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
Referenzen
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
