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Immunologie und Infektion

Pléthysmographie simplifiée du corps entier pour caractériser la fonction pulmonaire au cours de la mélioïdose respiratoire

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/62722
,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville, 2Center for Predictive Medicine,University of Louisville

Summary

Ce protocole présente la construction et l’utilisation d’un appareil simplifié de pléthysmographie du corps entier pour surveiller la progression des maladies respiratoires bactériennes de manière non invasive.

Abstract

Les modèles animaux de substitution de la maladie sont soumis aux 3R de la recherche responsable. Il y a un réexamen fréquent des améliorations apportées aux modèles animaux pour s’assurer que le bien-être animal et les connaissances scientifiques progressent avec la disponibilité des nouvelles technologies. Cet article démontre l’utilisation de la pléthysmographie simplifiée du corps entier (sWBP) pour étudier de manière non invasive l’insuffisance respiratoire dans un modèle de mélioïdose respiratoire mortelle. La sWBP a la sensibilité nécessaire pour détecter la respiration chez les souris tout au long de l’évolution de la maladie, ce qui permet de mesurer les symptômes moribonds associés (bradypnée et hypopnée) et éventuellement de les utiliser pour élaborer des critères d’évaluation sans cruauté.

Certains des avantages de la sWBP dans le contexte des maladies respiratoires sont que la surveillance de l’haleine de l’hôte se rapproche le plus de toute mesure physiologique pour évaluer le dysfonctionnement du tissu infecté primaire, à savoir le poumon. En plus de son importance biologique, l’utilisation de la sWBP est rapide et non invasive, ce qui minimise le stress chez les animaux de recherche. Ce travail démontre l’utilisation d’appareils sWBP internes pour surveiller la maladie tout au long de l’insuffisance respiratoire dans le modèle murin de la mélioïdose respiratoire.

Introduction

Les bactéries pathogènes respiratoires sont souvent associées à une réponse inflammatoire dans les poumons conduisant à une pathologie pulmonaire 1,2. Dans le cadre clinique, le diagnostic de la pneumonie comprend généralement des techniques de culture des expectorations, une analyse de la saturation en oxygène du sang et une radiographie pulmonaire. Ces techniques peuvent être traduites pour les modèles d’infection de petits animaux, mais seule l’analyse de la saturation en oxygène représente une analyse rapide et en temps réel chez la souris pour la gravité de la maladie. La saturation en oxygène du sang (SpO2) a déjà été étudiée comme méthode de suivi de la progression de la maladie dans les études sur les maladies respiratoires; cependant, les souris moribondes ont des lectures de SpO2 étonnamment élevées à la fois dans un modèle3 de Pseudomonas aeruginosa, qui ne sont pas la maladie prédictive ou moribonde, probablement parce que les souris peuvent moduler leur activité physiologique. À cette fin, les niveaux diagnostiques de SpO2 n’ont pas été trouvés pour les maladies respiratoires bactériennes chez les souris jusqu’à présent.

Par conséquent, ce travail a étudié l’utilisation d’autres méthodes cliniquement pertinentes pour détecter les effets de la maladie pulmonaire sur la fonction pulmonaire en tant que mesure physiologique rapide. La pléthysmographie simplifiée du corps entier (sWBP) offre la possibilité d’étudier la fréquence respiratoire et la profondeur en tant qu’analyse biométrique rapide et non invasive. Des études antérieures ont démontré comment assembler un appareil WBP dans un laboratoire4; Cependant, plusieurs des composants présentés dans ces études ne sont pas actuellement disponibles sur le marché. De plus, la WBP traditionnelle nécessite une collecte et un traitement de données complexes basés sur l’humidité et la température 5,6. Par conséquent, il a été décidé de développer un appareil WBP simplifié qui est étalonné quotidiennement à la température / humidité ambiante et d’évaluer si la contribution température / humidité du sujet lui-même a un effet sur le volume respiratoire mesuré. Ainsi, un appareil sWBP modifié a été créé qui fournit les matériaux actuellement disponibles. En outre, il a été étudié si cet appareil provenant de laboratoire peut détecter les changements respiratoires associés à la progression de la maladie au cours du modèle de mélioïdose respiratoire mortelle chez la souris.

L’appareil sWBP construit pour ce travail utilisait de l’équipement et des logiciels disponibles dans le commerce pour traiter les données des capteurs de pression analogiques en une lecture numérique. Le capteur de pression a été monté sur un bocal en verre étanche à l’air avec des connecteurs de cloison. L’avantage d’un bocal en verre est la rigidité structurelle du matériau, qui résistera aux changements de pression interne du pot, affectant les mesures des changements de volume lors de la surveillance de la respiration. La chambre de prélèvement a été conçue pour avoir deux ports sur les deux surfaces planes du pot carré, l’un pour accéder à la chambre par un connecteur Luer pour l’étalonnage et l’autre pour loger le capteur de pression. Le capteur de pression sélectionné dispose d’un transducteur de pression manométrique très sensible avec une plage pour les petits changements de pression (plage de 25 mbar).

Ce protocole est démontré à l’aide d’un modèle murin de mélioïdose respiratoire. Burkholderia pseudomallei (Bp) est l’agent bactérien de la mélioïdose – une maladie associée aux régions tropicales du monde7. La vitamine Bp se trouve dans l’environnement, en particulier dans les environnements humides d’eau stagnante et de sol humide, à partir de laquelle elle provoque généralement des infections sous-cutanées de coupures / égratignures d’hôtes sensibles. Cependant, le Bp est également infectieux lorsqu’il est inhalé et constitue une menace potentielle pour une utilisation dans le bioterrorisme par dispersion d’aérosols. Bien que la Bp entièrement virulente nécessite une manipulation dans un laboratoire BSL-3, une souche mutante acapsulaire a déjà été conçue, qui peut être manipulée en toute sécurité à BSL-2 et exclue du critère d’agent sélectionné8. De plus, un modèle d’infection intratrachéale médiée par intubation (IMIT) de la mélioïdose respiratoire a été développé pour étudier la progression de la maladie respiratoire de Bp 5,9. Nous avons utilisé ce modèle d’infection pour caractériser le changement respiratoire qui se produit au cours de la progression de la maladie jusqu’au critère d’évaluation moribond.

Protocol

Les procédures décrites ici ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université de Louisville (protocole # 14-038) et le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (protocole # 19567). 1. Assemblage de la chambre de prélèvement Créer deux trous à l’aide d’un foret diamanté de 3/4 po sur une perceuse sur les surfaces planes d’un bocal de mise en conserve Mason à large bouche en verre carré de 600 ml avec joint de 95 mm et couvercles hermétiques, avec couvercles de serrage et de gâchette (figure 1).REMARQUE : Une chambre d’échantillonnage n’est pas disponible dans le commerce et doit être construite. Assembler une cloison en laiton (filetage interne NPT 1/4 », filetage externe 3/4-16 UNF) à travers les deux trous du pot Mason à l’aide de rondelles en caoutchouc (3/4 » de diamètre intérieur, 1 » de diamètre extérieur) sur les deux faces de contact entre la cloison et le verre pour assurer une étanchéité à l’air. Utiliser une cloison pour un capteur de pression tout en fixant l’autre cloison par une seringue connectée Luer à des fins d’étalonnage.Pour le capteur de pression, enveloppez les filetages NPT 1/4 » d’un transducteur de pression manométrique haute performance avec du ruban en téflon et filez-les dans la cloison. Utilisez un fer à souder pour connecter le câblage du capteur de pression à un connecteur DIN mâle à 8 broches, en suivant les instructions de câblage du fabricant pour l’interface avec un dispositif d’acquisition de données de haute qualité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).REMARQUE: Cela nécessite l’utilisation d’une résistance à film métallique 150 K ohm 1/8 watt 1% dans le câblage du connecteur DIN. Pour l’orifice d’étalonnage, utilisez un adaptateur NPT mâle 1/4 » vers 1/8 » femelle NPT pour connecter un NPT mâle 1/8 » à un connecteur nickelé Luer femelle à la cloison en laiton enroulant les connexions filetées avec du ruban téflon. Utilisez un capuchon Luer mâle fileté en polypropylène pour sceller le connecteur Luer lorsqu’il n’est pas utilisé.REMARQUE: Ne serrez pas trop les connecteurs de cloison sur le bocal en verre, car cela créerait des fissures. Si vous le souhaitez, du silicone peut être ajouté aux joints en caoutchouc pour assurer une étanchéité à l’air des cloisons du bocal en verre. 2. Configuration du système Connectez la chambre de prélèvement à un amplificateur de pont à l’aide d’un connecteur DIN à 8 broches et l’amplificateur de pont au dispositif d’acquisition de données, en suivant les instructions du fabricant. Connectez le dispositif d’acquisition de données à une alimentation et à un ordinateur exécutant un logiciel d’analyse de données physiologiques à l’aide des câbles du fabricant.REMARQUE: Assurez-vous que le périphérique d’acquisition de données est allumé et réchauffé pendant au moins 5 minutes avant utilisation pour s’assurer que le capteur stabilise ses mesures. Lancez le logiciel pour qu’il s’interface avec le système d’acquisition de données. Téléchargez le module de spirométrie optionnel dans le logiciel et modifiez les paramètres d’unité par défaut de L/s à μL/s dans la fenêtre Paramètres de la spirométrie > . 3. Calibrage du système Dans le logiciel, créez une fenêtre à 4 canaux avec les fenêtres de données suivantes: Canal 1: Données sources à une fréquence d’échantillonnage de 4 k/s et une plage de 1 mV ; Canal 2: filtre numérique du canal 1 à l’aide d’un filtre de réglage automatique passe-haut de 1 Hz ; Canal 3 : Lissage des données du canal 2 par une moyenne de 100 échantillons; Canal 4 : Débit de spirométrie des données du canal 3 (tête de flux personnalisée, calibrée selon la formule (μL/s) = 120 000 x tension).REMARQUE : 120 000 est un coefficient de corrélation d’espace réservé qui sera modifié pendant l’étalonnage. Configurez l’analyse DataPad de Channel 4 avec les colonnes suivantes : Colonne 1 : Données du canal 4, commentaires > texte intégral des commentaires ; Colonne 2 : Données du canal 4, mesures cycliques > fréquence cyclique moyenne; Colonne 3 : Données du canal 4, mesures cycliques > hauteur cyclique moyenne. Définissez la fréquence d’images sur 100:1 dans le coin inférieur droit de l’affichage du graphique. Enregistrez cette configuration de fenêtre comme modèle pour toutes les études futures. Fermez le couvercle de la chambre d’échantillonnage et fixez une seringue étanche au gaz de 25 μL au connecteur de cloison Luer. Installez la seringue avec un adaptateur Chaney réglé pour délivrer à plusieurs reprises un volume de 20 μL.REMARQUE: Un morceau court optionnel de tube de 1/16 » et de connecteurs Luer/barbe peut être utilisé pour connecter la seringue à la chambre d’échantillonnage. Cependant, les longs tubes doivent être évités pour éviter des changements importants dans le volume d’air total de la chambre d’échantillonnage. Aspirez 20 μL d’air dans la seringue à l’aide de la butée en profondeur de l’adaptateur Chaney. Mettez à zéro le nombre dans le logiciel (Configuration > Zéro toutes les entrées (Alt-Z)) et démarrez un enregistrement. Pendant l’enregistrement, et avec une ligne de base stable, enfoncer/retirer rapidement le piston de la seringue pendant environ 10 répétitions pour reproduire la respiration du sujet avec une respiration mesurée de 20 μL. Arrêtez l’enregistrement.NOTE: La fréquence des respirations artificielles doit dépasser 2 Hz pour maximiser la reproductibilité de l’étalonnage. Étiquetez l’identité de l’échantillon mesuré en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le début de l’enregistrement numéroté et cliquez sur Ajouter un commentaire. Réinitialisez la seringue, mettez à zéro l’entrée et répétez les mesures d’enregistrement d’impulsions de 20 μL deux fois de plus (trois sessions d’enregistrement au total). Après avoir terminé toutes les mesures, utilisez la souris de l’ordinateur pour sélectionner une portion de respiration qui représente avec précision les respirations artificielles de 20 μL.REMARQUE: Dans le module DataPad, les données apparaîtront dans l’en-tête d’aperçu fournissant une lecture temporaire de la fréquence respiratoire (fréquence cyclique moyenne, Hz) et de la profondeur de respiration (hauteur cyclique moyenne, μL). L’aperçu des données peut être enregistré dans DataPad à l’aide de l’icône Ajouter au DataPad . Examinez les données de la colonne 3 (Hauteur cyclique moyenne) et calculez le volume moyen mesuré de l’haleine à partir des trois enregistrements. Effectuez le calcul suivant du volume moyen mesuré de l’haleine : Coefficient d’étalonnage = volume livré / volume mesuré x 120 000.REMARQUE : 120 000 était l’espace réservé Coefficient d’étalonnage de la tête d’écoulement utilisé à l’étape 3.1 maintenant modifié à partir des données mesurées. Le système est maintenant calibré pour la respiration typique de la souris en utilisant la température et l’humidité ambiantes actuelles. Le système peut maintenant surveiller la respiration du sujet, et l’étalonnage peut être répété quotidiennement pour tenir compte de toute fluctuation de température / humidité. 4. Surveillance des sujets Ouvrez un gabarit principal comme indiqué à l’étape 3.4 ou effectuez les étapes 4.2 à 4.3. Dans le logiciel, créez une fenêtre à 4 canaux avec le traitement des données suivant: Canal 1: Données sources à une fréquence d’échantillonnage de 4 k/s et une plage de 1 mV ; Canal 2 : filtre numérique du canal 1 à l’aide d’un filtre passe-haut 1 Hz Auto Adjust ; Canal 3: Lissage des données du canal 2 par une moyenne de 100 échantillons; Canal 4 : Débit de spirométrie des données du canal 3 (tête de flux personnalisée, calibrée selon la formule (μL/s) = 120 000 x tension).REMARQUE: 120 000 est le coefficient de corrélation calculé pour le capteur de pression de courant; Toutefois, l’utilisateur doit effectuer l’étalonnage du système décrit à l’étape 3 et utiliser ce coefficient de corrélation défini par l’utilisateur à la place. Configurez l’analyse DataPad de Channel 4 avec les colonnes suivantes : Colonne 1 : Données du canal 4, commentaires > texte intégral des commentaires ; Colonne 2 : Données du canal 4, mesures cycliques > fréquence cyclique moyenne; Colonne 3 : Données du canal 4, mesures cycliques > hauteur cyclique moyenne. Placer le sujet dans la chambre d’échantillonnage et fermer le couvercle. Pour cette expérience, une souris albinos femelle consciente de 4 à 12 semaines C57BL / 6J (B6 (Cg)-Tyrc-2J / J) a été utilisée. Égalisez la pression atmosphérique dans la chambre (en scellant le couvercle) en desserrant brièvement le capuchon de cloison Luer et en resserrant à nouveau. Observez que le sujet ne se déplace pas activement dans la chambre d’échantillonnage avant la mise à zéro de toutes les entrées (raccourci Alt-Z) et le début d’un enregistrement.REMARQUE : Si le sujet commence à se déplacer dans la chambre d’échantillonnage, la ligne de base peut s’éloigner de l’échelle, ce qui peut être résolu en remettant à zéro toutes les entrées au milieu d’un enregistrement, ce qui créera un nouvel enregistrement sur l’échelle. Supposons que le sujet s’engage dans l’exploration ou le toilettage pendant l’enregistrement; Notez quelle partie de l’enregistrement de pléthysmographie reflète le plus fidèlement la respiration normale. Étiquetez l’identité du sujet en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le début de l’enregistrement numéroté et cliquez sur Ajouter un commentaire. Remettez le sujet dans sa cage. Limitez le temps passé dans la chambre d’échantillonnage scellée à 5 minutes pour éviter l’asphyxie et le stress.REMARQUE : Le risque d’asphyxie est faible étant donné que le volume d’air de 600 mL de la chambre d’échantillonnage ne sera pas rapidement dépensé par une souris saine respirant à <15 mL/min. Utilisez la souris de l’ordinateur pour sélectionner une partie de la plénitude respiratoire qui représente avec précision la respiration du sujet.REMARQUE: Dans le module DataPad, les données apparaîtront dans l’en-tête d’aperçu fournissant une lecture temporaire de la fréquence respiratoire (fréquence cyclique moyenne, Hz) et du volume de respiration (hauteur cyclique moyenne, μL). L’aperçu des données peut être enregistré dans DataPad à l’aide de l’icône Ajouter au DataPad . Continuez à mesurer les souris sujettes une à la fois et à enregistrer des sections représentatives de la puissance respiratoire dans DataPad. Après l’enregistrement des données, exportez les données DataPad vers Excel. Calculez le volume minute comme suit : Volume minute (mL/min) = Fréquence respiratoire (Hz) x Volume de respiration (μl) x 0,06.

Representative Results

Calibrage du systèmeLe logiciel d’analyse de données permet l’étalonnage direct d’une tête de flux personnalisée, telle que celle décrite ici. Ceci est effectué lors du réglage du Spirometry Flow. Comme décrit à l’étape 3.1, il existe une option pour entrer le volume d’air d’étalonnage connu, qui calcule le coefficient de corrélation tension/volume dans le système. Ceci, cependant, génère un coefficient de corrélation basé sur une seule lecture, et il a été observé que la variation inhérente de l’étalonnage à partir d’un étalon n = 1 a une faible utilité. L’approche actuelle peut combler cette lacune et permet à un utilisateur d’effectuer un étalonnage quotidien en utilisant plusieurs lectures moyennées pour calculer un coefficient d’étalonnage. L’étalonnage avec 20 μL d’air injecté a été démontré ici, représentant un volume respiratoire haut de gamme typique chez une souris typique. Le logiciel suppose une interception d’origine (0,0) et est donc étalonné de 0 à 20 μL en utilisant cette approche. La méthodologie proposée ici pour sWBP étalonne quotidiennement, tenant ainsi compte de toute fluctuation de l’humidité / température ambiante. Les méthodes originales utilisées pour la WBP spécifique remontent à la méthodologie de Drorbaugh et Fenn de 1955, qui ont développé la WBP pour mesurer la ventilation chez les nourrissons humains5. Les calculs de Drorbaugh et Fenn tiennent compte des variations de température et d’humidité de l’environnement et du sujet. L’approche actuelle corrige les fluctuations environnementales en calibrant chaque session sWBP. Néanmoins, il a été décidé de déterminer si le chauffage et l’humidification de la respiration à travers la cavité nasale / poumon d’une souris affectent la mesure d’un volume d’air connu. Ainsi, un appareil artificiel a été créé pour imiter l’effet du sujet sur les mesures de chauffage et d’humidification de l’air calibré. Des connecteurs Luer ont été fixés à un tube conique de 15 ml et placés ce conique scellé en ligne entre la chambre d’échantillonnage et la seringue d’étalonnage étanche au gaz. Un étalonnage de 20 μL a été effectué à l’aide d’un tube conique vide maintenu à température ambiante (23 °C). Le tube conique a ensuite été partiellement rempli d’eau distillée juste en dessous des connecteurs Luer, laissant le temps d’équilibrer l’espace de tête du conique; Le volume d’étalonnage a ensuite été remesuré pour étudier l’effet de l’humidité. Le tube conique a été placé dans un bloc chauffant et équilibré à 37 °C dans un environnement humide, et finalement équilibré à 37 °C sans eau pour évaluer l’effet de l’échauffement du sujet et sans apport supplémentaire d’humidité. La figure 2 montre que toutes les conditions testées n’ont pas eu d’impact significatif sur la mesure étalonnée de 20 μL délivrée par la seringue étanche aux gaz. À partir de cette découverte, il a été conclu que la sWBP offre une approche accessible pour surveiller la respiration chez les animaux de recherche sans avoir besoin de calculs complexes fondés sur la température et l’humidité du sujet animal, car ceux-ci n’ont pas d’impact significatif sur le volume respiratoire mesuré. Suivi des sujetsLa sWBP a été utilisée pour surveiller la respiration pendant la maladie des infections respiratoires mortelles par l’agent pathogène bactérien B. pseudomallei. L’un des défis de la surveillance de la respiration chez les animaux conscients est la curiosité des animaux normaux en bonne santé se déplaçant dans la chambre d’échantillonnage. Le mouvement de la souris crée une ligne de base en mouvement constant qui peut être atténuée en partie en préconditionnant les sujets à la chambre sur une période de plusieurs jours avant la mesure. Ce problème affecte principalement la mesure de base chez les souris saines, car les sujets deviennent léthargiques pendant l’infection, ce qui rend la sWBP beaucoup plus gérable avec une activité réduite du sujet. Il peut être tentant d’essayer d’utiliser une certaine forme de contention, qu’elle soit physique ou anesthésique. L’utilisation de la contention physique peut affecter la respiration naturelle en causant du stress. De plus, on sait que l’utilisation d’anesthésiques a des effets prononcés sur la fréquence respiratoire et la profondeur10; ainsi, il a été décidé d’étudier l’impact de l’anesthésie avec l’appareil interne sWBP. L’isoflurane est couramment utilisé pour effectuer une imagerie diagnostique in vivo au cours des modèles d’infection et, par conséquent, une souris C57BL/6 a été anesthésiée et a surveillé la progression jusqu’à la récupération de l’anesthésie à l’aide de la sWBP. Cet essai a été mené avec une souris albinos juvénile de 4 semaines C57BL/6J pour prolonger la fenêtre de récupération après l’anesthésie. La figure 3 montre que l’anesthésique préféré provoque chez les souris un rythme respiratoire lent avec un grand volume d’air courant. Lorsque les souris commencent à se remettre de la sédation, leur rythme respiratoire augmente et le volume de la respiration diminue, avec pour effet net que l’air total inspiré augmente lentement. Dans cet essai, il a été constaté que le volume respiratoire est restauré aux niveaux pré-anesthésiques dans les 30 premières secondes de récupération. Le rythme respiratoire augmente régulièrement jusqu’à ce que la respiration de base soit rétablie 2 à 2,5 minutes après le retrait de l’anesthésie. Le volume minute suivait de près les effets de la fréquence respiratoire, atteignant le volume minute de base 2,5 minutes après le retrait de l’anesthésie. Cette constatation soutient que l’anesthésie ne devrait pas être utilisée dans l’approche sWBP. Il affecte considérablement la respiration de base, sans surprise, car l’anesthésie ralentira le métabolisme de l’hôte, créant une demande réduite d’oxygène inspiré. L’assainissement de la chambre d’échantillonnage doit également être envisagé entre les sujets pour aborder le contrôle des infections spécifiques à l’étude ainsi que l’impact des phéromones provenant de l’urine ou des matières fécales qui pourraient avoir un impact sur le stress entre les sujets. La WBP est une stratégie intéressante pour surveiller la fonction pulmonaire dans les modèles de maladies respiratoires de manière non invasive. La sWBP a été utilisée pour étudier les changements respiratoires au cours d’infections respiratoires mortelles par la mélioïdose (figure 4), avec des points temporels reflétant la surveillance de la bioluminescence dans les poumons. Il a été observé que ce modèle est associé à un début précoce de léthargie, qui persiste de manière lentement progressive jusqu’au développement de la maladie moribonde environ 3 jours après l’infection. Il a également été observé que le rythme respiratoire et l’air inspiré total (volume minute) des souris diminuent rapidement au cours du premier jour de l’infection et restent faibles pour le reste de l’infection (figure 4A,C). Ce schéma est compatible avec la léthargie précoce, qui persiste pendant les 2 prochains jours de l’infection. En revanche, le volume de la respiration ne diminue pas fortement au cours des premières 24 heures et a plutôt une diminution légère et régulière, qui se rapproche d’une baisse linéaire au cours des 3 jours de la maladie (Figure 4B). Figure 1 : appareil sWBP. Une chambre d’échantillonnage personnalisée a été construite à partir d’un bocal en verre carré scellable avec des connecteurs de cloison sur deux faces planes. Une cloison a été utilisée pour monter un capteur de pression manométrique connecté à un amplificateur de pont et un numériseur de dispositif d’acquisition de données via une connexion DIN à 8 broches. La deuxième cloison était équipée d’un connecteur Luer pour l’étalonnage par une seringue étanche aux gaz. L’appareil était connecté à un PC exécutant le logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Effet de la température et de l’humidité du sujet sur le volume de l’haleine. Un tube conique de 15 mL avec connecteurs Luer a été installé en ligne entre la seringue d’étalonnage de 20 μL et la chambre d’échantillonnage. Le système a été étalonné à 20 μL sans apport supplémentaire de température/humidité du tube conique. D’autres mesures ont été recueillies après l’équilibrage avec l’humidité saturée de l’eau distillée et/ou le réchauffement du tube conique de la température ambiante (23 °C) à la température corporelle (37 °C). Aucune différence significative n’a été détectée à partir de n = 5 mesures de chaque condition par ANOVA unidirectionnelle avec le post-test de comparaison multiple de Tukey. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Effet de l’anesthésie gazeuse sur la respiration chez la souris. Des données représentatives provenant d’une souris albinos femelle C57BL/6J âgée de 4 semaines (8,6 g) ont été mises sous sédation pendant 5 minutes avec 3 % d’isoflurane dans de l’oxygène et transférées dans une chambre d’échantillonnage sWBP. Les données de pléth ont été recueillies pendant 150 s après le retrait de l’anesthésie. Le sujet a commencé la marche initiale à 100 s après avoir été retiré de l’anesthésie. (A) Respiration de base avant anesthésie, mesurant une fréquence respiratoire de 4,97 Hz, un volume respiratoire de 9,74 μL et un volume de minute de 2,91 mL. (B) Les 60 premières secondes de changements respiratoires pendant la récupération de l’anesthésie. (A-B) Axe vertical mesurant μL par respiration et axe horizontal en secondes. (C-E) Les données de ventilation ont été recueillies au cours des 150 s de récupération de l’anesthésie, en moyenne à partir de ≥3 cycles respiratoires par point temporel pour (C) la fréquence respiratoire, (D) le volume respiratoire et le volume minute calculé (E). Les valeurs initiales pré-anesthésiques sont indiquées par une ligne pointillée horizontale dans chaque graphique respectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Effet de la mélioïdose respiratoire sur la respiration de l’hôte. Cinq souris femelles C57BL/6 de 8 semaines ont été infectées par 4,9 log UFC de la souche bioluminescente JW270 de B. pseudomallei. La sWBP a été menée tout au long des 3 jours d’infection, mesurant la fréquence respiratoire (A) et le volume respiratoire (B). L’air inspiré total a été calculé comme le volume minute (C). Les données pour chacun des cinq sujets sont tracées indépendamment avec une régression polynomiale du troisième ordre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

sWBP est une approche intéressante pour améliorer la compréhension des infections respiratoires dans les modèles de petits animaux. Il est important de noter qu’il s’agit d’une approche non invasive et, à ce titre, elle ne pose pas de risque important de causer un stress excessif aux animaux de recherche lors d’une provocation par infection. En effet, la procédure de surveillance de la respiration du sujet est un test rapide nécessitant plusieurs minutes et une manipulation minimale du sujet. L’avantage scientifique est la compréhension à haute résolution de la façon dont les agents pathogènes microbiens influencent la fonction pulmonaire pendant la maladie. Cette approche profitera à la recherche fondamentale, en facilitant la compréhension de la façon dont un agent pathogène cause une maladie, ainsi qu’une utilité translationnelle pour comprendre comment un nouveau traitement rétablit un sujet de recherche à un état de santé respiratoire.

Dans ce manuscrit, des résultats représentatifs sont fournis pour l’agent pathogène B. pseudomallei, qui provoque une réponse léthargique précoce. Toutes les infections pulmonaires bactériennes ne sont pas présentes de la même manière dans les modèles d’infection chez la souris. L’expérience antérieure avec d’autres modèles d’infection a démontré que l’agent pathogène bactérien Klebsiella pneumoniae se présente comme une infection asymptomatique jusqu’au moment où les souris succombent à l’infection, également vers le jour 3 post-infection11. On suppose que la demande de l’hôte en air inspiré (c.-à-d. volume infime) peut être étroitement liée au degré de léthargie avec lequel une maladie donnée se présente. Des études futures seront nécessaires pour examiner comment différents agents pathogènes bactériens affectent la fonction pulmonaire pendant la maladie respiratoire. Il est entendu que différents agents pathogènes ont des approches uniques pour échapper à la défense de l’hôte, y compris des différences dans (1) la propension à être des pathogènes intracellulaires ou extracellulaires, (2) la capacité de provoquer une réponse hypothermique précoce / tardive et (3) l’utilisation de différents répertoires de déterminants de virulence 3,12,13. Par conséquent, il est probable que différentes stratégies de la maladie entraîneront des effets uniques sur la fonction pulmonaire et la respiration pendant l’infection.

Les paramètres recommandés décrits dans ce protocole peuvent être modifiés pour s’adapter aux défis uniques présents lors de la sWBP. L’un des problèmes courants rencontrés lors d’une session d’enregistrement sWBP est le mouvement du sujet dans la chambre d’échantillonnage. Comme mentionné, ce mouvement modifie la ligne de base et peut affecter la précision des mesures respiratoires. Un filtre numérique a été utilisé pour normaliser la ligne de base changeante, permettant des mesures viables de l’haleine malgré de petits mouvements. Un mouvement excessif peut pousser une mesure de base hors de la portée d’une entrée mise à zéro. Les enregistrements sont recommandés à une portée de 1 mV (réglage du canal 1), ce qui permet de compromettre l’observation continue des pics de pléthysmographie tout en évitant la perte de données en dehors de la plage. Pour les sujets exceptionnellement actifs, il peut être nécessaire d’étendre la plage d’enregistrement >1 mV pour éviter les signaux persistants hors plage.

La procédure recommandée exige un étalonnage quotidien (ou à chaque séance) pour tenir compte des fluctuations de l’humidité et de la température ambiantes. Le WBP traditionnel utilise des calculs complexes qui tiennent compte de la température / humidité de l’environnement et du sujet 5,6. Il a été démontré que dans l’appareil sWBP actuel, les effets de la température/humidité de l’hôte ne modifient pas de manière significative le volume respiratoire mesuré d’une source d’étalonnage. Par conséquent, cette approche dans sWBP diffère fondamentalement de l’approche vieille de >50 ans de Drorbaugh et Fenn. Ici, sWBP relie directement les changements de pression à un volume respiratoire mesuré sans autre correction de la part de l’hôte.

Il est essentiel de comparer la WBP animale de recherche à celle de la WBP clinique. Les types de données biométriques que l’on a tenté de recueillir par sWBP sont le volume et la fréquence de la respiration. Ces mesures sont recueillies cliniquement à l’aide d’un simple équipement de spirométrie dans lequel un patient tient un moniteur d’haleine à sa bouche et respire normalement dans un appareil de surveillance du flux d’air. Une spirométrie similaire chez les animaux de recherche nécessite de la retenue, contribuant ainsi au stress et à une perturbation inhérente de la respiration. Par conséquent, la spirométrie simple est fonctionnelle cliniquement, mais pas pour les animaux de recherche. WBP sert un objectif essentiel dans la clinique pour recueillir des données avancées, y compris des mesures telles que le volume pulmonaire résiduel. De telles données ne peuvent être contenues que dans le contexte d’un sujet capable de suivre des instructions sur la façon dont il respire, y compris l’expiration forcée (vidange de son poumon par une expiration profonde). On ne peut pas compter sur les animaux de recherche pour suivre les instructions respiratoires d’un chercheur. Bon nombre des mesures avancées recueillies cliniquement au cours de la WBP ne peuvent pas être reproduites chez les animaux de recherche. La WBP chez les animaux de recherche est fondamentalement différente de la WBP clinique. Animal WBP cherche à recueillir des données de ventilation simples (fréquence respiratoire et volume) de manière non restreinte pour éviter le stress animal et les perturbations respiratoires. Jusqu’à présent, l’utilisation de la WBP chez les animaux de recherche semble reproduire les techniques utilisées dans la WBP clinique, y compris des calculs complexes basés sur la température et l’humidité de l’environnement et du sujet, mais sans la capacité de recueillir les données avancées d’un sujet qui peut suivre les instructions sur la façon d’effectuer une expiration forcée. Dans cette optique, on a cherché à démontrer si une version simplifiée de la WBP suffirait à recueillir la fréquence et le volume respiratoires pertinents pour les études sur les maladies respiratoires. Une séance d’étalonnage a été utilisée, ce qui a compensé toute variation de température et d’humidité ambiantes. De plus, il a été démontré avec une souris artificielle que la température et l’humidité soumises à un volume respiratoire mesuré n’ont aucun effet significatif sur la mesure précise du volume de l’haleine. Il a été conclu que sWBP a une excellente application à la recherche sur les études animales, sans que l’utilisateur ait besoin d’utiliser un traitement mathématique fastidieux des données.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces études ont été soutenues par la subvention COBRE P20GM125504-01 du sous-projet 8246 des National Institutes of Health.

Materials

1/8" NPT Luer adaptor Amazon B07DH9MY8W Calibration port
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor Amazon B07T6CR6FS Bulkhead to luer adaptor
150 kohm resistor Amazon B07GPRYL81 Pressure transducer excitation voltage selection
3/4" diamond drill bit Drilax DRILAX100425 To drill bulkhead mounts in glass jar
Bridge Amp AD Instruments FE221 One channel option
Bulkhead fitting Legines 3000L-B 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling
Chaney adaptor Hamilton 14725 Gas tight syringe adaptor for set volume
DIN connector AD Instruments SP0104 To connect pressure sensor to Bridge Amp
Gastight syringe, 25 uL Hamilton 80201 Calibration syringe
LabChart AD Instruments Life Science Data Acquisition Software
Luer plug Cole Parmer 45513-56 Calibration port closure
PowerLab 4/26 AD Instruments PL2604 Digital interface to computer
Pressure transducer Omega Engineering PX409-10WGV High accuracy oil filed gage pressure sensor
Rubber gasket Amazon B07LH4C8LS To mount bulkheads (4 required per chamber)
Square glass jar Amazon B07VNSPR8P 600 ml with 95 mm silicone gasket
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Referenzen

  1. Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
  2. West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
  3. Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
  4. Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
  5. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  6. Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
  7. Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
  8. Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
  9. Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
  10. Rocco, P. R. M., Zin, W. A., Gullo, A. . Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. , (2002).
  11. Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
  12. Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
  13. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).

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Simplified Whole Body PlethysmographyLung FunctionRespiratory MelioidosisNon-restrained AnimalsSpirometryData AcquisitionCalibrationData AnalysisCyclic MeasurementsPlethysmography

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Diesen Artikel zitieren
Olson, J. M., Warawa, J. M. Simplified Whole Body Plethysmography to Characterize Lung Function During Respiratory Melioidosis. J. Vis. Exp. (192), e62722, doi:10.3791/62722 (2023).
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