Solunum Melioidozu Sırasında Akciğer Fonksiyonunu Karakterize Etmek için Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografisi
Summary
Bu protokol, bakteriyel solunum yolu hastalığının ilerlemesini invaziv olmayan bir şekilde izlemek için Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografi aparatının yapımını ve kullanımını sunar.
Abstract
Vekil hayvan hastalık modelleri, Sorumlu Araştırmanın 3R’sine tabidir. Hem hayvan refahının hem de bilimsel anlayışların yeni teknolojilerin mevcudiyeti ile ilerlemesini sağlamak için hayvan modellerinde iyileştirmelerin sık sık yeniden gözden geçirilmesi söz konusudur. Bu makalede, ölümcül solunum melioidozu modelinde solunum yetmezliğini invaziv olmayan bir şekilde incelemek için Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografisinin (sWBP) kullanımı gösterilmektedir. sWBP, hastalığın seyrinin tamamı boyunca farelerde nefes almayı tespit etme duyarlılığına sahiptir ve can çekişen ilişkili semptomların (bradipne ve hipopne) ölçülmesine ve potansiyel olarak insancıl son nokta kriterleri geliştirmek için kullanılmasına izin verir.
Solunum yolu hastalığı bağlamında sWBP’nin faydalarından bazıları, konakçı nefes izlemesinin, birincil enfekte dokunun, yani akciğerin işlev bozukluğunu değerlendirmede herhangi bir fizyolojik ölçüme en yakın olmasıdır. Biyolojik önemine ek olarak, sWBP’nin kullanımı hızlı ve invaziv değildir, bu da araştırma hayvanlarında stresi en aza indirir. Bu çalışma, solunum melioidozunun murin modelinde solunum yetmezliği seyri boyunca hastalığı izlemek için şirket içi sWBP aparatının kullanımını göstermektedir.
Introduction
Respiratuar bakteriyel patojenler sıklıkla akciğerde akciğer patolojisine yol açan inflamatuar bir yanıt ile ilişkilidir 1,2. Klinik ortamda, pnömoni tanısı tipik olarak balgam, kan-oksijen doygunluk analizi ve göğüs röntgeninden kültür tekniklerini içerir. Bu teknikler küçük hayvan enfeksiyonu modelleri için çevrilebilir, ancak yalnızca oksijen doygunluğu analizi, farelerde hastalık şiddeti için hızlı, gerçek zamanlı bir analizi temsil eder. Kan oksijen doygunluğu (SpO2) daha önce solunum yolu hastalığı çalışmalarında hastalığın ilerlemesini izlemek için bir yöntem olarak araştırılmıştır; Bununla birlikte, can çekişen fareler, hem Pseudomonas aeruginosa model3’te beklenmedik derecede yüksek SpO2 okumalarına sahiptir, bunlar öngörücü veya can çekişen hastalık değildir, çünkü muhtemelen fareler fizyolojik aktivitelerini modüle edebilirler. Bu amaçla, şimdiye kadar farelerde bakteriyel solunum yolu hastalığı için SpO2’nin tanısal seviyeleri bulunamamıştır.
Bu nedenle, bu çalışmada hızlı fizyolojik ölçüm olarak akciğer hastalığının akciğer fonksiyonu üzerindeki etkilerini saptamak için klinik olarak ilgili diğer yöntemlerin kullanımı araştırılmıştır. Basitleştirilmiş Tüm Vücut Pletismografisi (sWBP), hızlı, invaziv olmayan bir biyometrik analiz olarak nefes hızını ve derinliğini araştırma fırsatı sunar. Önceki çalışmalar, WBP cihazının bir laboratuvarda nasıl monte edileceğini göstermiştir4; Bununla birlikte, bu tür çalışmalarda gösterilen bileşenlerin birçoğu şu anda ticari olarak temin edilememektedir. Ayrıca, geleneksel WBP, nem ve sıcaklığa dayalı karmaşık veri toplama ve veri işleme gerektirir 5,6. Bu nedenle, günlük olarak oda sıcaklığına/neme göre kalibre edilen basitleştirilmiş bir WBP aparatı geliştirilmesine ve konunun sıcaklık/nem katkısının ölçülen nefes hacmi üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığının değerlendirilmesine karar verilmiştir. Böylece, şu anda mevcut malzemeleri tedarik eden modifiye edilmiş bir sWBP aparatı oluşturulmuştur. Ayrıca, bu laboratuvar kaynaklı aparatın, farelerde ölümcül solunum melioidoz modeli sırasında hastalık ilerlemesi ile ilişkili solunumdaki değişiklikleri tespit edip edemediği araştırılmıştır.
Bu çalışma için inşa edilen sWBP cihazı, analog basınç sensörü verilerini dijital bir okumaya işlemek için piyasada bulunan ekipman ve yazılımları kullandı. Basınç sensörü, bölme konektörlerine sahip hava geçirmez bir cam kavanoza takıldı. Bir cam kavanozun yararı, kavanozun iç basıncındaki değişikliklere direnecek ve solunumun izlenmesi sırasında hacim değişikliklerinin ölçümlerini etkileyecek malzemenin yapısal sertliğidir. Numune alma odası, kare kavanozun iki düz yüzeyinde, biri kalibrasyon için bir Luer konektörü ile odaya erişmek ve diğeri basınç sensörünü barındırmak için iki bağlantı noktasına sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Seçilen basınç sensörü, basınçtaki küçük değişiklikler için bir aralığa (25 mbar aralığı) sahip oldukça hassas bir gösterge basınç transdüserine sahiptir.
Bu protokol, solunum melioidozunun bir murin modeli kullanılarak gösterilmiştir. Burkholderia pseudomallei (Bp), dünyanın tropikal bölgeleriyle ilişkili bir hastalık olan melioidozun bakteriyel ajanıdır7. Bp, çevrede, özellikle durgun su ve nemli toprağın ıslak ortamlarında bulunur ve tipik olarak hassas konakçıların kesiklerinin / çiziklerinin deri altı enfeksiyonlarına neden olur. Bununla birlikte, Bp solunduğunda da bulaşıcıdır ve aerosol dispersiyonu ile biyoterörizmde kullanım için potansiyel bir tehdittir. Tamamen virülan Bp’nin bir BSL-3 laboratuvarında elleçlenmesini gerektirmekle birlikte, BSL-2’de güvenli bir şekilde ele alınabilen ve seçilen ajan kriterleri8’in dışında tutulabilen bir kapsüler mutant suşu daha önce tasarlanmıştı. Ayrıca, Bp 5,9’un solunum yolu hastalığı progresyonunu incelemek için entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) bir solunum melioidoz enfeksiyon modeli geliştirilmiştir. Bu enfeksiyon modelini, hastalığın can çekişen son nokta boyunca ilerlemesi sırasında meydana gelen solunum değişikliğini karakterize etmek için kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
sWBP, küçük hayvan modellerinde solunum yolu enfeksiyonunun anlaşılmasını geliştirmek için çekici bir yaklaşımdır. Önemli olarak, invaziv olmayan bir yaklaşımdır ve bu nedenle, bir enfeksiyon zorluğu sırasında araştırma hayvanlarına aşırı strese neden olma konusunda önemli bir risk oluşturmaz. Gerçekten de, denek solunumunu izleme prosedürü, birkaç dakika ve minimum konu kullanımı gerektiren hızlı bir testtir. Bilimsel yarar, mikrobiyal patojenlerin hastalık sırasında akciğer fonksiyonunu nasıl etkilediğinin yüksek çözünürlüklü bir şekilde anlaşılmasıdır. Bu yaklaşım, bir patojenin hastalığa nasıl neden olduğunun anlaşılmasını kolaylaştıran temel araştırmalara fayda sağlayacak ve yeni bir terapinin solunum sağlığı durumuna tabi bir araştırmayı nasıl geri yüklediğini anlamak için translasyonel bir fayda sağlayacaktır.
Bu yazıda, erken uyuşuk yanıta neden olan patojen B. pseudomallei için temsili sonuçlar verilmiştir. Tüm bakteriyel akciğer enfeksiyonları fare enfeksiyonu modellerinde aynı şekilde bulunmaz. Diğer enfeksiyon modelleriyle ilgili önceki deneyimler, bakteriyel patojen Klebsiella pneumoniae’nin, farelerin enfeksiyona yenik düştüğü noktaya kadar, aynı zamanda enfeksiyon sonrası yaklaşık 3. Gün11’de asemptomatik bir enfeksiyon olarak ortaya çıktığını göstermiştir. Konakçının ilham verici havaya olan talebinin (yani, dakika hacmi), belirli bir hastalığın ortaya çıktığı uyuşukluk derecesiyle yakından ilişkili olabileceği varsayılmıştır. Farklı bakteriyel patojenlerin solunum yolu hastalığı sırasında akciğer fonksiyonunu nasıl etkilediğini incelemek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Farklı patojenlerin, (1) hücre içi veya hücre dışı patojenler olma eğilimi, (2) erken / geç hipotermik yanıta neden olma yeteneği ve (3) virülans belirleyicilerinin farklı repertuarlarının kullanımı 3,12,13 gibi farklılıklar da dahil olmak üzere konakçı savunmasından kaçınmak için benzersiz yaklaşımlara sahip oldukları anlaşılmaktadır. Bu nedenle, farklı hastalık stratejilerinin enfeksiyon sırasında akciğer fonksiyonu ve solunum üzerinde benzersiz etkilere neden olması muhtemeldir.
Bu protokolde açıklanan önerilen ayarlar, sWBP sırasında ortaya çıkan benzersiz zorluklara uyum sağlayacak şekilde değiştirilebilir. Bir sWBP kayıt oturumu sırasında karşılaşılan yaygın sorunlardan biri, öznenin Örnek Odası içindeki hareketidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu hareket taban çizgisini değiştirir ve solunum ölçümlerinin doğruluğunu etkileyebilir. Değişen taban çizgisini normalleştirmek için bir Dijital filtre kullanıldı ve küçük hareketlere rağmen uygulanabilir nefes ölçümlerine izin verildi. Aşırı hareket, bir taban çizgisi ölçümünü sıfırlanmış bir girdi aralığının dışına itebilir. Kayıtlar 1 mV aralığında önerilir (Kanal 1 ayarı), bu da aralık dışındaki veri kaybını önlerken pletismografinin zirvelerini hala gözlemlemekten ödün verir. Olağanüstü aktif deneklerde, sürekli aralık dışı sinyalleri önlemek için kayıt aralığını >1 mV’a uzatmak gerekebilir.
Önerilen prosedür, çevresel nem/sıcaklık dalgalanmalarına uyum sağlamak için günlük kalibrasyon (veya her seansta) gerektirir. Geleneksel WBP, hem ortamın hem de konu 5,6’nın sıcaklığını/nemini etkileyen karmaşık hesaplamalar kullanır. Mevcut sWBP cihazında, konakçı sıcaklığının/neminin etkilerinin bir kalibrasyon kaynağının ölçülen nefes hacmini önemli ölçüde değiştirmediği gösterilmiştir. Bu nedenle, sWBP’deki bu yaklaşım, Drorbaugh ve Fenn’in >50 yıllık yaklaşımından temelde farklıdır. Burada, sWBP, basınç değişikliklerini doğrudan ölçülen bir nefes hacmine bağlar ve konakçıdan başka bir düzeltme yapılmaz.
Araştırma hayvanı WBP’sini klinik WBP’ninkiyle karşılaştırmak önemlidir. sWBP tarafından toplanmaya çalışılan biyometrik veri türleri nefes hacmi ve frekansıdır. Bu tür ölçümler, bir hastanın ağzına bir nefes monitörü tuttuğu ve normal olarak hava akışını izleyen bir cihaza nefes aldığı basit spirometri ekipmanı kullanılarak klinik olarak toplanır. Araştırma hayvanlarında benzer spirometri kısıtlama gerektirir, bu nedenle strese ve solunumda doğal bir bozulmaya katkıda bulunur. Bu nedenle, basit spirometri klinik olarak işlevseldir, ancak araştırma hayvanları için değildir. WBP, klinikte artık akciğer hacmi gibi ölçümler de dahil olmak üzere gelişmiş verilerin toplanması için önemli bir amaca hizmet eder. Bu tür veriler yalnızca, bir deneğin Zorla Son Kullanma (akciğerlerinin derin bir nefes verme ile boşaltılması) dahil olmak üzere nasıl nefes aldıklarına dair talimatları izleyebilmesi bağlamında bulunabilir. Araştırma hayvanlarına bir araştırmacının solunum talimatlarını takip etmeleri için güvenilemez. WBP sırasında klinik olarak toplanan gelişmiş ölçümlerin çoğu araştırma hayvanlarında çoğaltılamaz. Araştırma hayvanlarında WBP, klinik WBP’den temel olarak farklıdır. Animal WBP, hayvan stresini ve solunum pertürbasyonunu önlemek için basit havalandırma verilerini (nefes hızı ve hacmi) kısıtlanmamış bir şekilde toplamayı amaçlamaktadır. Şimdiye kadar, WBP’nin araştırma hayvanlarında kullanılması, çevresel ve konu sıcaklığı ve neme dayalı karmaşık hesaplamalar da dahil olmak üzere klinik WBP’de kullanılan teknikleri çoğaltıyor gibi görünmektedir, ancak zorla sona erme işleminin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin talimatları izleyebilen bir konudan gelişmiş verileri toplama yeteneği yoktur. Bunu akılda tutarak, WBP’nin basitleştirilmiş bir versiyonunun, solunum yolu hastalığı çalışmaları ile ilgili ilgili solunum sıklığını ve hacmini toplamak için yeterli olup olmayacağını göstermeye çalışılmıştır. Ortam sıcaklığı ve nemindeki herhangi bir değişikliği telafi eden bir kalibrasyon oturumu yapıldı. Ayrıca, ölçülen bir nefes hacmine sıcaklık ve nemin maruz kaldığı yapay bir fare ile gösterilmiştir, nefes hacminin doğru bir şekilde ölçülmesinde önemli bir etkisi yoktur. sWBP’nin, kullanıcının verilerin hantal matematiksel muamelesini kullanmasına gerek kalmadan, hayvan çalışmalarını araştırmak için mükemmel bir uygulamaya sahip olduğu sonucuna varılmıştır.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri COBRE hibesi P20GM125504-01 Alt Proje 8246 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
Referenzen
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A., Gullo, A. . Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. , (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
