Оптимизированная система O9-1/Hydrogel для изучения механических сигналов в клетках нервного гребня

Клетки нервных гребней (NCC) представляют собой группу стволовых клеток во время эмбриогенеза позвоночных с замечательной способностью мигрировать и способствовать развитию различных органов и тканей. NCC могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая сенсорные нейроны, хрящи, кости, меланоциты и гладкомышечные клетки, в зависимости от местоположения осевого происхождения и местного экологического руководства NCC^1,2. Обладая способностью дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, генетические аномалии, вызывающие дисрегуляцию на любой стадии развития нервного гребня (НК), могут привести к многочисленным врожденным заболеваниям^2. Например, возмущения во время формирования, миграции и развития NCC приводят к нарушениям развития, известным в совокупности как нейрокристопатии^1,3. Эти заболевания варьируются от черепно-лицевых дефектов из-за сбоя в образовании NCC, таких как синдром Тричера Коллинза, до развития различных видов рака из-за метастатической мигрирующей способности NCC, как видно при меланоме^3,4,5,6. За последние несколько десятилетий исследователи сделали замечательные открытия о роли и механизмах NCC в развитии и заболеваниях, причем большинство результатов сосредоточены на химических сигналах^7,8. Совсем недавно было указано, что механические сигналы играют решающую, но плохо понятную роль в разработке NCC^9,10.

Экологические сигналы NCC играют решающую роль во время их развития, включая регулирование дифференцировки NCC в различные типы клеток. Сигналы окружающей среды, например, физические сигналы, влияют на ключевое поведение и клеточные реакции, такие как функциональная диверсификация. Механотрансдукция позволяет клеткам ощущать и реагировать на эти сигналы для поддержания различных биологических процессов^2. NCC окружены соседними клетками и различными субстратами, такими как внеклеточный матрикс (ECM), который может давать начало механическим стимулам для поддержания гомеостаза и адаптации к изменениям посредством определения судьбы, пролиферации и апоптоза^11. Механотрансдукция начинается на плазматической мембране, где происходит сенсорный компонент механических внеклеточных раздражителей, в результате чего происходит внутриклеточная регуляция клетки^12. Интегрины, фокальные спайки и соединения плазматической мембраны ретранслируют механические сигналы, такие как силы сдвига, напряжение и жесткость окружающих субстратов, в химические сигналы для получения клеточных реакций^12. Ретрансляция химических сигналов от плазматической мембраны к конечной клеточной регуляции осуществляется через различные сигнальные пути для завершения жизненно важных для организма процессов, таких как дифференцировка.

Несколько исследований показали, что механическая сигнализация от жесткости субстрата играет роль в дифференцировке клеток^13,14. Например, предыдущие исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выращенные на мягких субстратах с жесткостью, аналогичной жесткости ткани мозга (в диапазоне 0,1-1,0 кПа), приводили к дифференцировке нейрональных клеток^15,16. Однако больше МСК дифференцируются в миоцитоподобные клетки при выращивании на субстратах 8-17 кПа, имитирующих жесткость мышц, в то время как остеобластная дифференцировка наблюдалась при культивировании МСК на жестких субстратах (25-40 кПа)^15,16. Значение механотрансдукции подчеркивается нарушениями и аномалиями в механическом сигнальном пути, которые потенциально приводят к тяжелым дефектам развития и заболеваниям, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и остеопороз^17,18,19. При раке нормальная ткань молочной железы мягкая, и риск рака молочной железы увеличивается в жесткой и плотной ткани молочной железы, среда, которая больше похожа на опухоли молочной железы^15. Обладая этими знаниями, влияние механической сигнализации на развитие NCC может быть изучено путем простого манипулирования жесткостью субстрата через систему in vitro, обеспечивая дополнительные преимущества и возможности в понимании основ прогрессирования и этиологии заболеваний, связанных с NC.

Для изучения влияния механических сигналов в НКЦ создана эффективная система in vitro для ННК, основанная на оптимизации ранее опубликованных методов и оценке реакций НКЦ на различные механические сигналы^20,21. Был разработан подробный протокол для получения различной жесткости гидрогеля и оценки воздействия механической сигнализации в НКЦ. Для достижения этой цели NCC O9-1 используются в качестве модели NC для изучения эффектов и изменений в ответ на жесткие и мягкие гидрогели. O9-1 NCC представляют собой стабильную клеточную линию NC, выделенную из эмбриона мыши (E) в день 8,5. O9-1 NCC имитируют NCC in vivo, потому что они могут дифференцироваться в различные типы клеток, полученных из NC, в определенных дифференцировочных средах^22. Для изучения механической сигнализации ННК изготавливали матричную подложку с перестраиваемой эластичностью из изменяющихся концентраций растворов акриламида и бис-акриламида для достижения желаемой жесткости, коррелирующей с жесткостью биологического субстрата^20,21,23. Для оптимизации условий матричной субстрата для NCC, в частности O9-1 клеток, были сделаны модификации из ранее опубликованного протокола^20. Одно из изменений, внесенных в этот протокол, заключалось в инкубации гидрогелей в коллагене I, разбавленном в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES, при 37 °C в течение ночи. Низкий рН уксусной кислоты приводит к однородному распределению и более высокому включению коллагена I, что позволяет более равномерно присоединять белок ECM^24. Кроме того, комбинацию конской сыворотки и фетальной бычьей сыворотки (FBS) использовали в концентрациях 10% и 5% в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) соответственно перед хранением гидрогелей в инкубаторе. Конская сыворотка использовалась в качестве дополнительной добавки к FBS из-за ее способности способствовать пролиферации и дифференцировке клеток в концентрации 10%^25.

С помощью этого метода биологическая среда была имитирована белковым покрытием ECM (например, коллагеном I), чтобы создать точную среду in vitro для NCC, чтобы расти и выживать^20,21. Жесткость подготовленных гидрогелей была количественно проанализирована с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM), хорошо известного метода для изображения модуля упругости^26. Чтобы изучить влияние различных уровней жесткости на NCC, клетки дикого типа O9-1 культивировали и готовили на гидрогелях для окрашивания иммунофлуоресценцией (IF) против нитевидного актина (F-актина), чтобы показать различия в адгезии и морфологии клеток в ответ на изменения жесткости субстрата. Используя эту систему in vitro, исследователи смогут изучить роль механической сигнализации в NCC и ее взаимодействие с другими химическими сигналами, чтобы получить более глубокое понимание взаимосвязи между NCC и механической сигнализацией.