Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine Gruppe von Stammzellen während der Embryogenese von Wirbeltieren mit einer bemerkenswerten Fähigkeit zu wandern und zur Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe beizutragen. NCCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich sensorischer Neuronen, Knorpel, Knochen, Melanozyten und glatter Muskelzellen, abhängig von der Lage des axialen Ursprungs und der lokalen Umweltführung des NCC^1,2. Mit der Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, können genetische Anomalien, die in jedem Stadium der Neuralleistenentwicklung (NC) eine Dysregulation verursachen, zu zahlreichen angeborenen Erkrankungen führen². Zum Beispiel führen Störungen während der Bildung, Migration und Entwicklung von NCCs zu Entwicklungsstörungen, die zusammen als Neurokristopathien^1,3bekannt sind. Diese Krankheiten reichen von kraniofazialen Defekten aufgrund eines Versagens der NCC-Bildung, wie dem Treacher-Collins-Syndrom, bis hin zur Entwicklung verschiedener Krebsarten aufgrund der metastasierenden Migrationsfähigkeit des NCC, wie sie beim Melanom^3,4,5,6beobachtet wird . In den letzten Jahrzehnten haben Forscher bemerkenswerte Entdeckungen über die Rollen und Mechanismen von NCCs in der Entwicklung und bei Krankheiten gemacht, wobei sich die Mehrheit der Ergebnisse auf chemische Signale konzentriert^7,8. In jüngerer Zeit wurde darauf hingewiesen, dass mechanische Signale eine kritische, aber wenig verstandene Rolle in der NCC-Entwicklung^{spielen 9,10}.

Die Umwelthinweise von NCCs spielen während ihrer Entwicklung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Regulierung der NCC-Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Umwelteinflüsse, z. B. physikalische Hinweise, beeinflussen das entscheidende Verhalten und die zellulären Reaktionen, wie z. B. die funktionelle Diversifizierung. Die Mechanotransduktion ermöglicht es den Zellen, diese Hinweise zu spüren und darauf zu reagieren, um verschiedene biologische Prozesse aufrechtzuerhalten². NCCs sind von benachbarten Zellen und verschiedenen Substraten wie der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, die mechanische Reize hervorrufen können, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und sich durch Schicksalsbestimmung, Proliferation und Apoptose an die Veränderungen anzupassen¹¹. Die Mechanotransduktion beginnt an der Plasmamembran, wo die sensorische Komponente mechanischer extrazellulärer Reize auftritt, was zur intrazellulären Regulation der Zelle^{führt 12}. Integrine, fokale Adhäsionen und Verbindungen der Plasmamembran leiten mechanische Signale wie Scherkräfte, Spannung und Steifigkeit der umgebenden Substrate in chemische Signale um, um zelluläre Reaktionen zu erzeugen¹². Die Weiterleitung chemischer Signale von der Plasmamembran zur endgültigen zellulären Regulation erfolgt über verschiedene Signalwege, um lebenswichtige Prozesse für den Organismus, wie z.B. die Differenzierung, abzuschließen.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die mechanische Signalübertragung aus der Substratsteifigkeit eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt^13,14. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die auf weichen Substraten mit einer Steifigkeit ähnlich der von Hirngewebe (im Bereich von 0,1-1,0 kPa) gezüchtet wurden, zu einer neuronalen Zelldifferenzierung führten^15,16. Allerdings differenzieren sich mehr MSCs in myozytenähnliche Zellen, wenn sie auf 8-17 kPa-Substraten gezüchtet werden, die die Steifigkeit des Muskels nachahmen, während osteoblastenartige Differenzierung beobachtet wurde, wenn MSCs auf steifen Substraten kultiviert wurden (25-40 kPa)^15,16. Die Bedeutung der Mechanotransduktion wird durch die Unregelmäßigkeiten und Anomalien im mechanischen Signalweg hervorgehoben, die möglicherweise zu schweren Entwicklungsdefekten und -krankheiten führen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Osteoporose^17,18,19. Bei Krebserkrankungen ist normales Brustgewebe weich, und das Brustkrebsrisiko steigt in steifem und dichtem Brustgewebe, einer Umgebung, die eher Brusttumoren^{ähnelt 15}. Mit diesem Wissen können die Auswirkungen der mechanischen Signalgebung auf die NCC-Entwicklung durch einfache Manipulation der Substratsteifigkeit durch ein In-vitro-System untersucht werden, was weitere Vorteile und Möglichkeiten zum Verständnis der Grundlagen des NC-bedingten Krankheitsverlaufs und der Ätiologie bietet.

Um den Einfluss mechanischer Signale in NCCs zu untersuchen, haben wir ein effizientes In-vitro-System für NCCs etabliert, das auf der Optimierung zuvor veröffentlichter Methoden und der Bewertung der Reaktionen von NCCs auf verschiedene mechanische Signale basiert^20,21. Es wurde ein detailliertes Protokoll für die unterschiedliche Vorbereitung der Hydrogelsteifigkeit und die Bewertung der Auswirkungen der mechanischen Signalgebung in NCCs bereitgestellt. Um dies zu erreichen, werden O9-1 NCCs als NC-Modell verwendet, um die Auswirkungen und Veränderungen als Reaktion auf steife gegenüber weichen Hydrogelen zu untersuchen. O9-1 NCCs sind eine stabile NC-Zelllinie, die am Tag 8.5 aus dem Mausembryo (E) isoliert wurde. O9-1 NCCs ahmen NCCs in vivo nach, weil sie sich in definierten Differenzierungsmedien in verschiedene NC-abgeleitete Zelltypen differenzieren können²². Um die mechanische Signalisierung von NCCs zu untersuchen, wurde ein Matrixsubstrat mit abstimmbarer Elastizität aus unterschiedlichen Konzentrationen von Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen hergestellt, um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen, die der biologischen Substratsteifigkeit^20,21,23entspricht. Um die Bedingungen des Matrixsubstrats für NCCs, insbesondere O9-1-Zellen, zu optimieren, wurden Modifikationen aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll²⁰vorgenommen. Eine Änderung in diesem Protokoll bestand darin, Hydrogele in Kollagen I, verdünnt in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, bei 37 ° C über Nacht zu inkubieren. Der niedrige pH-Wert der Essigsäure führt zu einer homogenen Verteilung und einem höheren Kollagen-I-Einbau, wodurch eine gleichmäßigere Bindung des ECM-Proteins²⁴ermöglicht wird. Darüber hinaus wurde eine Kombination aus Pferdeserum und fetalem Rinderserum (FBS) in Konzentrationen von 10% bzw. 5% in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) verwendet, bevor die Hydrogele im Inkubator gelagert wurden. Pferdeserum wurde als zusätzliche Ergänzung zu FBS aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, die Zellproliferation und -differenzierung bei einer Konzentration von 10% zu fördern²⁵.

Mit dieser Methode wurde eine biologische Umgebung durch die ECM-Proteinbeschichtung (z. B. Kollagen I) nachgeahmt, um eine genaue In-vitro-Umgebung für NCCs zu schaffen, um zu wachsen und zu überleben^20,21. Die Steifigkeit der präparierten Hydrogele wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls^26,quantitativ analysiert. Um die Wirkung unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus auf NCCs zu untersuchen, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen kultiviert und auf Hydrogelen für die Immunfluoreszenz (IF) -Färbung gegen filamentöses Aktin (F-Aktin) vorbereitet, um die Unterschiede in der Zelladhäsion und Morphologie als Reaktion auf Veränderungen der Substratsteifigkeit zu zeigen. Mit diesem In-vitro-System werden die Forscher in der Lage sein, die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit anderen chemischen Signalen zu untersuchen, um ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen NCCs und mechanischer Signalgebung zu erlangen.