בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים
Summary
מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.
Abstract
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) יכולים להחליף את הביטוי שלהם ואת פרופיל הציטוקינים שלהם על פי גירויים חיצוניים. פלסטיות יוצאת דופן זו מאפשרת ל- TAM להסתגל לשינויים מתמשכים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול. מקרופאגים יכולים להיות בעיקר תכונות פרו דלקתיות (דמויי M1) או אנטי דלקתיות (דמויי M2) ויכולים לעבור ללא הרף בין שתי המדינות העיקריות הללו. מקרופאגים דמויי M2 בסביבת הגידול קשורים להתקדמות הסרטן ופרוגנוזה ירודה במספר סוגים של סרטן. שיטות רבות ושונות לגרימת בידול וקיטוב של תאי THP-1 משמשות לחקירת מנגנונים תאיים ובין תאיים והשפעות TAM בתוך המיקרו-סביבה של גידולים. נכון לעכשיו, אין מודל מבוסס לקיטוב מקרופאגים דמוי M2 באמצעות קו התא THP-1, ותוצאות פרופילי הביטוי והציטוקינים של מקרופאגים בשל גירויים במבחנה מסוימים משתנות בין מחקרים. פרוטוקול זה משמש הדרכה מפורטת כדי להבדיל בין תאים דמויי THP-1 מונוציט למקרופאגים M0 ולקטב עוד יותר תאים לתוך פנוטיפ דמוי M2 בתוך 14 ימים. אנו מדגימים את השינויים המורפולוגיים של תאים דמויי THP-1, מקרופאגים מובחנים ומקרופאגים מקוטבים דמויי M2 באמצעות מיקרוסקופיה קלה. מודל זה הוא הבסיס למודלים של קו התאים החוקרים את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM ואת האינטראקציות שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרות של microenvironment הגידול.
Introduction
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) ותפקידם בדלקת כרונית, תחילת הסרטן והתפתחות הגידול הם מטרות חשובות במחקר האחרון1,2. מונוציטים דם היקפיים המגויסים למיקרו-סביבה של הגידול המתפתח מבדילים למקרופאגים וניתן לקוטב לשני תתי סוגים עיקריים של מקרופאגים3. המקרופאג’ המופעל קלאסית מייצג את הפנוטיפ דמוי M1 הפרו-דלקתי בעיקר ותת-סוג דמוי M2 המופעל לחילופין מראה מאפיינים אנטי דלקתיים בעיקר4. מקרופאגים יכולים לעבור באופן דינמי בין שני פנוטיפים עיקריים אלה בהתאם לחילוף החומרים התאי שלהם, עם תת-סוגים ביניים בעלי תכונות דלקתיות ואנטי דלקתיות5. TAM מייצג אוכלוסייה הטרוגנית של שני הפנוטיפים. פונקציה לקידום גידול ופרוגנוזה ירודה בסוגים שונים של סרטן קשורה במיוחד למקרופאגים דמויי M26,7,8.
הפרופילים התפקודיים של מקרופאגים והאינטראקציה שלהם עם תאים אחרים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול הם מורכבים ומאתגרים ללכידה בסביבה המשתנה ללא הרף במהלך התפתחות גידול מתמשכת. קווי תאים יכולים לספק לאוכלוסיית תאים הומוגנית יכולת כדאיות יציבה בתרבות, אשר יכולה להקל על תהליך הדגמת מנגנונים תאיים ובין תאיים מוגדרים. קו התאים דמוי מונוציט THP-1 הוא מערכת מודל לגיטימית למונוציטים אנושיים ראשוניים9. קו תאים מונצח באופן ספונטני זה הושג מדם היקפי של תינוק בן שנה עם לוקמיה מונוציטיתחריפה 9,10. הבידול והקיטוב של תאי THP-1 דווחו על ידי מספר מחקרים ובוצעו בדרכים שונות מרובות11,12,13,14. הפעלה, ולכן, הקיטוב של מקרופאגים לתוך פנוטיפ דמוי M1 מלווה מנגנון ריבאונד אנטי דלקתי מפצה, קידום פנוטיפ דמוי M2 באמצעות ציטוקינים המיוצרים על ידי מקרופאגים דלקתיים, כגון אינטרלוקין 6 (IL-6) או itaconate15,16. זה עשוי לשמש כמנגנון שבירה כדי להחלשות תגובה דלקתית overshooting לאחר הפעלת התא17. תהליך ההבחנה והקיטוב של מונוציטים ותאים דמויי THP-1 לפנוטיפ אנטי דלקתי דמוי M2 מלווה בעצמו גם בגירויים פרו דלקתיים שיש להתגבר עליהם. תגובת ציטוקינים דלקתית יכולה להיגרם על ידי מתח מכני18, כגון שינוי מדיה כדי להזין מחדש את התאים, או הוספת תרכובות כימיות כדי להבדיל בין תאי THP-1, כגון פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ולזירוז ייצור של גורם נמק הגידול α (TNFα), אינטרלוקין 1β (IL-1β) או IL-619. פרופיל ביטוי ציטוקינים שונה זה כתגובה ל- PMA יכול להשפיע ולמנוע קיטוב מקרופאגים עוקב20. תקופות מנוחה נאותות, כפי שדווח בעבר לאחר טיפול PMA, לאפשר תגובות דלקתיות אלה כדי להקטין ולהקל על קיטוב התא לתוך פנוטיפ M2-כמו ברור21.
פרוטוקול זה מדגים שיטה להבדיל ולקטב תאים דמויי THP-1 לתוך פנוטיפ דמוי M2 של מקרופאגים בתוך 14 ימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה על הבחנה וקיטוב תאים דמויי THP-1 בתוך 14 ימים מספק שיטה להשיג מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2 נפרד עקב דגירה טיפול ארוכה של תאים עם תקופות מנוחה נאותה בין שלבים.
שלבים מסוימים הם קריטיים לפרוטוקול זה. זמן ההכפלה של מונוציטים THP-1 הוא כ 26 שעות. תאים יכולים להיות מפוצלים בצפי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מכון המחירים למחקר כירורגי, אוניברסיטת לואיוויל, נתמך כלכלית על ידי ג’ון ו. פרייס וברברה דרופון אטווד פרייס טראסט. למקורות המימון לא היה כל תפקיד בעיצוב וביצוע המחקר וכן באיסוף, ניהול, ניתוח ופרשנות הנתונים.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
Referenzen
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
