Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

Arttırıcılar, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olarak hizmet eden genomik cis-düzenleyici elemanlardır ve bir hedef genin ekspresyonunu mekansal olarak zamansal olarak spesifik bir şekilde yönlendirebilir ^1,2. Farklı hücre tiplerinde, dokularda ve gelişim aşamalarında farklı şekilde aktiftirler ve hastalık riskine bağlı genomik varyasyonun substratları olabilirler ^3,4. Bu nedenle, arttırıcı fonksiyonun dinamiklerini anlama ihtiyacı, genomik içindeki hem translasyonel hem de temel bilim uygulamalarında ilerleme için kritik öneme sahiptir. Arttırıcı aktivitenin In silico tahminleri, arttırıcı yetenek ^5,6 ile ilgili hipotezler üretmek için mükemmel kaynaklar olarak hizmet edebilir. Bu tür öngörülen arttırıcı aktivite, fonksiyonel aktivitenin tam olarak anlaşılması için ek doğrulama ve sorgulama gerektirebilir. Enhancer muhabir tahlilleri, hücrelerden hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde bu amaç için değerli olduğunu kanıtlamıştır ^7,8,9. Bu çalışmaları esnek ve uygun maliyetli bir in vivo bağlamda genişletmeye yönelik olarak, bu protokol, doğum sonrası fare beyninde ektopik bir muhabir geninin ekspresyonunu sürme yetenekleri için varsayılan arttırıcı dizileri test etmek için in vivo AAV tabanlı yöntemlerin kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntem ailesi, tek aday dizileri veya paralel kütüphane taramasını sorgulamak için faydalıdır ve temel ve translasyonel araştırmalarla ilgilidir.

Bu yöntem, tek bir plazmidde, varsayılan bir arttırıcı aday DNA dizisini, tek başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen minimal bir promotörün kontrolü altında, bir muhabir geni (burada EGFP) ile birleştirir. Plazmid, rekombinant AAV’ye (rAAV) paketlenir ve bir hayvan modeline enjekte edilir. Buradaki uygulama beyne yapılırken, çeşitli rAAV serotipleri farklı doku tiplerinde enfeksiyona olanak tanır, böylece bu yaklaşım diğer sistemlere genişletilebilir¹⁰. Bir süre sonra, beyin toplanabilir ve muhabir geninin ifadesi için test edilebilir. Güçlü ifade, kontrollerle karşılaştırıldığında, test edilen aday dizisinin genin ekspresyonunu “geliştirebildiğini” gösterir (Şekil 1). Bu basit tasarım, beyindeki arttırıcı aktivite için bir diziyi test etmek için kolay ve net bir yaklaşım sunar.

Bir dizinin arttırıcı kabiliyetinin test edilmesine ek olarak, bu yöntem hücre tipi arttırıcı aktivitesini belirlemek için tekniklerle birleştirilebilir. Diferansiyel arttırıcı aktivitesini belirlemeye yönelik sekans tabanlı yaklaşımlarda, DNA ve RNA diziliminden önce hücreleri hücre tipine özgü belirteçler üzerinde sıralamak, araştırmacıların Gisselbrecht ve ^ark.11’de açıklandığı gibi, farklı hücre tiplerinin diferansiyel arttırıcı aktivite gösterip göstermediğini belirlemelerine izin verebilir. Görüntüleme tabanlı yaklaşımlarda, görüntülerin hücre tipine özgü belirteçlerle birlikte etiketlenmesi, arttırıcı güdümlü floresan sergileyen hücrelerin aynı zamanda ilgilenilen hücre tipi belirteçleri de gösterip göstermediğinin incelenmesine olanak tanır 12,13,14,15,16. Enhancer muhabir testleri, arttırıcılardaki riskle ilişkili allelik varyasyonun, arttırıcı kapasitesi üzerindeki etkileri açısından doğrudan test edilmesini sağlar. Genom çapında ilişkilendirme çalışmalarında (GWAS) tanımlanan risk lokuslarının büyük çoğunluğu, genomun kodlamayan bölgelerinde yatmaktadır¹⁷. Bu risk lokuslarının fonksiyonel ek açıklama çalışmaları, büyük bir kısmının muhtemelen arttırıcı olarak hareket ettiğini göstermektedir^18,19,20. In vivo MPRA dağıtımı, beyindeki arttırıcı aktivite için bu riskle ilişkili varyantların test edilmesine izin verebilir^12,21. Son olarak, farklı zaman noktalarında teslimat ve toplama, bir geliştiricinin aktif olduğu gelişim aşamaları hakkında içgörüler sunabilir.

Geliştirici-muhabir plazmid tasarımları çeşitlidir ve deneysel hedeflere uyacak şekilde özelleştirilebilir. Geliştirici araştırmalarında kullanılan minimal promotörler için insan β-globin minimal promotör²² ve fare Hsp68 minimal promoter²³ gibi çeşitli seçenekler vardır. Bu destekleyicilerin, onları etkinleştirmek için bir geliştirici unsurla birleştirilmediği sürece düşük ifade seviyelerini yönlendirdiği bilinmektedir. Buna karşılık, kurucu promotör elemanlar, transgenin güçlü ekspresyonunu yönlendirir, pozitif kontrol için veya güçlendirici fonksiyonu sağlam bir ifadenin arka planına karşı test etmek için kullanışlıdır. Kurucu destekleyiciler için yaygın seçenekler arasında tavuk β aktin promotöründen türetilen hibrit bir promotör olan CAG ve sitomegalovirüs hemen-erken arttırıcı²⁴ veya insan EF1α²⁵ bulunur. Arttırıcıların çift yönlü olarak çalıştığı bilindiğinden²⁶, arttırıcının minimum promotöre göre oryantasyonu ve konumu esnektir (Şekil 2A). Geleneksel geliştirici-muhabir analizleri, geliştiriciyi destekleyicinin yukarı akışını yerleştirir ve kütüphane teslimatlarında, sıralama okumalarını test edilen geliştirici²⁷ ile ilişkilendirmek için muhabir geninin aşağı yönünde bir barkod dizisi içerir. Bununla birlikte, arttırıcılar muhabir geninin açık okuma çerçevesine de yerleştirilebilir ve STARR-seq^28’de yapıldığı gibi kendi barkod dizileri olarak hizmet edebilir. Burada açıklanan protokol, STARR-seq tahlil tasarımını kullanır ve aday arttırıcı dizisini muhabir geninin 3′ UTR’sine yerleştirir. STARR-seq oryantasyonu daha akıcı klonlamanın faydasını sunarken, geleneksel yaklaşımdan daha az anlaşılmıştır ve yapılar arasında değişken RNA stabilitesini indükleyebilir. Tarif edilen yöntemler, başka bir yerde tarif edilen klonlama işleminde küçük değişikliklerle STARR-seq veya konvansiyonel yönelime kolayca uyarlanabilir^27,29.

Bu tekniği deneysel hedeflere uyacak şekilde daha da özelleştirmek için farklı AAV dağıtım yöntemleri kullanılabilir (Şekil 2B). Bu protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan doğrudan kafa içi enjeksiyonlar, doğrudan beyne yüksek konsantrasyonda virüs verir³⁰. Bu, enjeksiyon bölgesinde merkezlenmiş yüksek bir transdüksiyon verimliliği sağlar, bu da bunu, bir doku alanı üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak isteyen deneyler için mükemmel bir teknik haline getirir. Stereotaktik enjeksiyon, tekrarlanabilir lokalize transdüksiyon için hayvanlar arasında enjeksiyon bölgesini standartlaştırmaya yardımcı olabilir. İntrakraniyal enjeksiyonlar erken postnatal hayvanlarda en basittir. Alternatif bir teknik olarak, sistemik enjeksiyonlar, kan-beyin bariyerini geçebilen serotiplere sahip AAV’leri kullanarak transgenler verebilir³¹. Kuyruk damarı enjeksiyonları, virüsün vücutta dolaşmasına izin vererek birçok dokuda genelleştirilmiş doğum sağlar¹⁰. Retro-orbital enjeksiyonlar, gözün arkasındaki virüsü retro-orbital sinüs^32’ye ileten başka bir sistemik enjeksiyon tekniğidir. Bu, AAV için venöz sistemden beyne daha doğrudan bir yol sunar ve beyinde daha periferik kan damarlarına yapılan enjeksiyonlardan daha yüksek bir transdüke hücresi konsantrasyonu ile sonuçlanır³³.

Bu tekniğin bir başka esnek yönü de okuma yöntemidir. Genel olarak, seçenekler muhabir tabanlı veya sıralama tabanlı olarak tanımlanabilir (Şekil 2C). GFP gibi bir floresan muhabirini yapının açık okuma çerçevesine dahil etmek, aday arttırıcının ifadeyi sürdüğü herhangi bir dönüştürülmüş hücrede floresan proteininin ekspresyonuyla sonuçlanır. İmmünohistokimya gibi etiketleme ve görüntüleme teknikleri sinyal amplifikasyonunu mümkün kılar. Dizileme tabanlı okuma teknikleri, dokudan toplanan RNA’da verilen yapıdan dizileri tanımlamayı içerir. Başlangıçta teslim edilen viral DNA miktarını ölçerek, eksprese edilen RNA ile verilen DNA’nın karşılaştırılması, test edilmiş bir arttırıcı dizisinin, örneğin kitlesel olarak paralel bir muhabir testi (MPRA) bağlamında, transgenin artan ekspresyonunu ne derece yönlendirebildiğini belirlemek için kullanılabilir. MPRA’lar, aynı anda aktivite için binlerce aday arttırıcıyı test etmek için bu tekniklerin güçlü bir genişlemesini sunar ve genomik araştırmalarda 12,27,34,35,36 kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Aday arttırıcılar için klonlama, paketleme, teslimat ve sıralama adımlarının tek tek değil, toplu olarak gerçekleştirilmesiyle daha yüksek verim taraması elde edilir.

Aday geliştirici seçimi, esneklik için başka bir fırsat sağlar (Şekil 2D). Örneğin, bu tahlil, belirli bir genin arttırıcılarını tanımlamak, ilgilenilen kodlamayan DNA bölgelerinin işlevini belirlemek veya bir arttırıcının aktif olduğu spesifik hücre tiplerini veya gelişim aşamalarını belirlemek için kullanılabilir – bunların hepsi hem temel bilimde hem de hastalık araştırmalarında hedeflere hizmet eder. Genel olarak, aday arttırıcı seçimi, arttırıcı aktivitenin in silico tahminleri tarafından yönlendirilir. Yaygın olarak, in silico tahminleri, H3K27ac³⁷ ve kromatin erişilebilirlik haritalaması³⁸ gibi olası arttırıcıları gösteren histon modifikasyonları için ChIP-seq’i içerir. Son olarak, büyüyen bir araştırma alanı, sentetik olarak tasarlanmış arttırıcı elemanların fonksiyon tabanlı taranmasıdır, bu da arttırıcı dizinin fonksiyon^39’u nasıl yönlendirdiğine ve belirli özelliklere sahip arttırıcıların tasarımına dair çalışmalara olanak tanır⁴⁰.