마우스 뇌 에서 생체 내 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포
Summary
이 프로토콜은 새로운 rAAV 기반 과도 인핸서-리포터 분석을 설명합니다. 이 분석은 마우스 뇌 에서 생체내에서 인핸서 구동 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.
Abstract
인핸서는 조직 및 세포 유형 특이적 유전자의 특정 발현 패턴을 유도하는 다양한 전사 인자에 대한 결합 플랫폼입니다. 비코딩 DNA 및 다양한 염색질 상태를 평가하는 여러 수단은 게놈에서 인핸서 서열의 존재를 예측하는 데 유용한 것으로 입증되었지만 이러한 서열의 활성을 검증하고 이들이 활동하는 장기 및 발달 단계를 찾는 것은 노동 집약적인 과정입니다. 최근 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 발전으로 이식유전자를 마우스 조직에 광범위하게 전달할 수 있게 되어 형질전환 동물 없이도 생체 내 인핸 서 테스트가 가능합니다. 이 프로토콜은 그 자체로 유의한 발현을 유도하지 않는, 최소 프로모터의 제어 하에 EGFP를 발현하는 리포터 작제물이 마우스 뇌에서 후보 인핸서 서열의 활성 패턴을 연구하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여준다. AAV 패키지 리포터 작제물을 마우스 뇌에 전달하고 1-4주 동안 배양한 후 동물을 희생시키고 뇌 절편을 현미경으로 관찰합니다. EGFP는 테스트 된 인핸서가 유전자 발현을 시작하기에 충분한 세포에서 나타나며, 인핸서가 뇌에서 활성화되는 위치와 발달 단계를 정확히 지적합니다. 표준 클로닝 방법, 저비용 AAV 패키징, AAV 혈청형 확장 및 생체 내 전달 및 표준 영상 판독을 위한 방법은 뇌에서 유전자 발현이 조절되는 방식에 대한 연구에 접근 가능한 접근 방식을 만듭니다.
Introduction
인핸서는 전사 인자 결합 부위 역할을하는 게놈 시스 조절 요소이며 시공간적으로 특이적인 방식으로 표적 유전자의 발현을 유도 할 수 있습니다 1,2. 이들은 다양한 세포 유형, 조직 및 발달 단계에서 차별적으로 활성이며 질병 위험 관련 게놈 변이 3,4의 기질이 될 수 있습니다. 따라서 인핸서 기능의 역학을 이해해야 할 필요성은 유전체학 내에서 번역 및 기초 과학 응용 프로그램 모두에서 발전하는 데 중요합니다. 인핸서 활성의 인실리코 예측은 인핸서 능력 5,6에 대한 가설을 생성하기 위한 훌륭한 자원으로 작용할 수 있다. 이러한 예측된 인핸서 활성은 기능적 활성의 완전한 이해를 위해 추가적인 검증 및 질의를 필요로 할 수 있다. 인핸서 리포터 분석은 세포에서 동물에 이르기까지 다양한 시스템에서 이러한 목적에 가치가 있음이 입증되었습니다 7,8,9. 유연하고 비용 효율적인 과도 생체 내 맥락에서 이러한 연구를 확장하기 위해 이 프로토콜은 출생 후 마우스 뇌에서 이소성 리포터 유전자의 발현을 유도하는 능력에 대해 추정 인핸서 서열을 테스트하기 위해 생체 내 AAV 기반 방법의 사용을 설명합니다. 이 방법 계열은 단일 후보 서열 또는 병렬 라이브러리 스크리닝을 조사하는 데 유용하며 기본 및 중개 연구와 관련이 있습니다.
이 방법은 단일 플라스미드에서 추정 인핸서 후보 DNA 서열을 리포터 유전자 (여기서는 EGFP)와 결합시키고, 단독으로 유의한 발현을 유도하지 않는 최소 프로모터의 제어 하에 있다. 플라스미드는 재조합 AAV(rAAV)로 패키징되고 동물 모델에 주입됩니다. 여기에서의 적용이 뇌에 있는 반면, 다양한 rAAV 혈청형은 상이한 조직 유형에 걸친 감염을 가능하게 하여, 이러한 접근법이 다른 시스템(10)으로 확장될 수 있다. 일정 기간 후, 뇌를 수집하여 리포터 유전자의 발현을 분석할 수 있다. 대조군과 비교하여 강한 발현은 시험된 후보 서열이 유전자의 발현을 “향상”시킬 수 있었음을 나타냅니다(그림 1). 이 단순한 디자인은 뇌에서 생체 내에서 인핸서 활성에 대한 서열을 테스트하는 쉽고 명확한 접근 방식을 제공합니다.
서열의 인핸서 능력에 대한 시험 이외에, 이 방법은 세포형 인핸서 활성을 결정하기 위한 기술과 조합될 수 있다. 차등 인핸서 활성을 결정하기 위한 서열 기반 접근법에서, DNA 및 RNA 시퀀싱 전에 세포 유형-특이적 마커 상의 세포를 분류함으로써 연구자들은 Gisselbrecht et al.11에 기술된 바와 같이 상이한 세포 유형이 차등 인핸서 활성을 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 이미징 기반 접근법에서, 세포 유형 특이적 마커를 갖는 공동 표지 이미지는 인핸서 구동 형광을 나타내는 세포가 관심 있는 세포 유형 마커12,13,14,15,16도 표시하는지 여부를 검사할 수 있게 한다. 인핸서 리포터 분석은 인핸서 능력에 미치는 영향에 대해 인핸서의 위험 관련 대립 유전자 변이를 직접 테스트 할 수 있습니다. 게놈 전체 연관 연구 (GWAS)에서 확인 된 대부분의 위험 유전자좌는 게놈17의 비 코딩 영역에 있습니다. 이러한 위험 유전자좌의 기능적 주석 연구는 많은 부분이 인핸서18,19,20으로 작용할 가능성이 있음을 나타냅니다. 생체내 MPRA 배치는 뇌12,21에서 인핸서 활성에 대한 이러한 위험 관련 변이체의 테스트를 허용할 수 있다. 마지막으로, 서로 다른 시점에서의 전달 및 수집은 인핸서가 활성화되는 발달 단계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
인핸서-리포터 플라스미드 디자인은 다양하며 실험 목표에 맞게 맞춤화할 수 있습니다. 인핸서 연구에 사용되어 온 최소 프로모터에 대한 몇 가지 옵션이 있는데, 예를 들어 인간 β글로빈 최소 프로모터22 및 마우스 Hsp68 최소 프로모터23. 이들 프로모터는 이를 활성화시키는 인핸서 요소와 결합되지 않는 한 낮은 수준의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, 구성적 프로모터 요소는 도입유전자의 강한 발현을 유도하여, 양성 대조군 또는 강건한 발현의 배경에 대한 인핸서 기능을 시험하는데 유용하다. 구성적 프로모터에 대한 일반적인 선택은 CAG, 닭 β-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 인핸서24, 또는 인간 EF1α25로부터 유래된 하이브리드 프로모터를 포함한다. 인핸서가 양방향성으로 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에(26), 최소 프로모터에 대한 인핸서의 배향 및 위치는 가요성이다(도 2A). 전통적인 인핸서-리포터 분석은 인핸서를 프로모터의 상류에 배치하고, 라이브러리 전달에서, 시퀀싱 판독을 시험된 인핸서27과 연관시키기 위해 리포터 유전자의 하류에 바코드 서열을 포함한다. 그러나, 인핸서는 또한 리포터 유전자의 개방 판독 프레임에 배치될 수 있고, STARR-seq28에서 행해지는 바와 같이, 그들 자신의 바코드 서열로서 기능할 수 있다. 여기에 기술된 프로토콜은 STARR-seq 분석 설계를 이용하여, 후보 인핸서 서열을 리포터 유전자의 3′ UTR 내로 배치한다. STARR-seq 배향은 보다 간소화된 클로닝의 이점을 제공하지만 기존 접근 방식보다 잘 이해되지 않으며 구축물 간에 다양한 RNA 안정성을 유도할 수 있습니다. 설명된 방법은 STARR-seq 또는 종래의 배향에 용이하게 적응될 수 있으며, 다른 곳(27,29)에 기술된 클로닝 공정에 대한 약간의 변경이 있을 수 있다.
다양한 AAV 전달 방법을 사용하여 실험 목표에 맞게 이 기술을 추가로 맞춤화할 수 있습니다(그림 2B). 이 프로토콜에서 추가로 설명되는 직접 두개내 주사는 고농도의 바이러스를 뇌(30)에 직접 전달한다. 이것은 주사 부위를 중심으로 높은 형질 도입 효율을 제공하므로 조직 영역에서 형질 도입 된 세포의 밀도를 최대화하려는 실험에 탁월한 기술입니다. 정위 주사는 재현 가능한 국소 형질 도입을 위해 동물 전반에 걸쳐 주사 부위를 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 두개 내 주사는 출생 후 초기 동물에서 가장 간단합니다. 대안적인 기술로서, 전신 주사는 혈액-뇌 장벽(31)을 통과할 수 있는 혈청형을 갖는 AAV를 사용하여 전이유전자를 전달할 수 있다. 꼬리-정맥 주사는 바이러스가 몸 전체를 순환하도록 하여 많은 조직에 걸쳐 일반화된 전달을 가능하게 합니다10. 역-안와 주사는 눈 뒤의 바이러스를 후-안와 부비동32로 전달하는 또 다른 전신 주사 기술이다. 이것은 정맥계로부터 뇌로의 AAV에 대한보다 직접적인 경로를 제공하며, 그 결과 더 많은 말초 혈관(33)으로의 주사보다 뇌 내의 형질 도입 된 세포의 농도가 더 높다.
이 기술의 또 다른 유연한 측면은 판독 방법입니다. 대체로 옵션은 리포터 기반 또는 시퀀싱 기반으로 설명할 수 있습니다(그림 2C). GFP와 같은 형광 리포터를 작제물의 개방 판독 프레임에 통합하면 후보 인핸서가 발현을 유도하는 임의의 형질도입된 세포에서 형광 단백질이 발현됩니다. 면역조직화학과 같은 라벨링 및 이미징 기술은 신호 증폭을 가능하게 합니다. 시퀀싱 기반 판독 기술은 조직으로부터 수집된 RNA에서 전달된 구축물로부터 서열을 식별하는 것을 포함한다. 초기에 전달된 바이러스 DNA의 양을 정량화함으로써, 발현된 RNA 대 전달된 DNA의 비교는 예를 들어 대규모 병렬 리포터 분석(MPRA)의 맥락에서 시험된 인핸서 서열이 전이유전자의 발현 증가를 유도할 수 있는 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. MPRA는 동시에 활동에 대해 최대 수천 개의 후보 인핸서를 테스트하기 위해 이러한 기술의 강력한 확장을 제공하며 유전체학 연구 12,27,34,35,36에서 광범위하게 설명되었습니다. 더 높은 처리량 스크리닝은 후보 인핸서에 대한 클로닝, 패키징, 전달 및 시퀀싱 단계를 개별적으로가 아닌 배치로 실행하여 달성됩니다.
후보 인핸서 선택은 유연성을 위한 또 다른 기회를 제공합니다(그림 2D). 예를 들어, 이 분석은 특정 유전자의 인핸서를 식별하거나, 관심 있는 비코딩 DNA 영역의 기능을 확인하거나, 인핸서가 활성화되는 특정 세포 유형 또는 발달 단계를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이들 모두는 기초 과학 및 질병 연구 모두에서 목표를 달성한다. 일반적으로, 후보 인핸서 선택은 인핸서 활성의 인실리코 예측에 의해 주도된다. 일반적으로, 인실리코 예측은 H3K27ac(37 ) 및 염색질 접근성 맵핑(38)과 같은 가능성 있는 인핸서를 나타내는 히스톤 변형에 대한 ChIP-seq를 포함한다. 마지막으로, 성장하는 연구 분야는 합성적으로 설계된 인핸서 요소의 기능 기반 스크리닝으로, 인핸서 서열이 기능을 지시하는 방법(39 ) 및 특정 특성(40)을 갖는 인핸서의 설계에 대한 연구를 가능하게 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 출생 후 마우스 뇌에 인핸서 구동 전이유전자를 배치하기 위한 rAAV 기반 방법을 설명합니다. 이 일반화된 프로토콜에서, 후보 인핸서, 최소 프로모터, 리포터 유전자 및 선택적 바코드 서열이 AAV 플라스미드 백본으로 클로닝된다. 이러한 실험은 단일 후보 인핸서 서열 또는 병렬로 많은 서열로 수행할 수 있습니다. 플라스미드는 rAAV로 포장되어 출생 후 마우스 뇌로 전달됩니다. 바?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
시퀀싱은 UC Davis DNA Technologies Core에서 수행되었습니다. 우리는 rAAV 포장에 대한 교육을 제공하고 AAV 도우미 및 반복/캡 플라스미드를 아낌없이 선물해 준 UC Davis의 Lin Tian의 실험실에 감사드립니다. 이 작업은 NIH / NIGMS R35GM119831의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
| 5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| 5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
| Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
| Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
| Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
| Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
| Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
| Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
| Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
| Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
| Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
| HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
| IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
| LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
| McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
| Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
| NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | |
| Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
| Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
| Powdered milk | Sunny Select | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
| Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
| Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
| Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
| SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
| Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
| TAE buffer | Apex | 20-194 | |
| Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |
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