유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR
Summary
이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.
Abstract
최근 모기 유전체학 및 유전 공학 기술의 발전은 표적 DNA 서열 변이를 대규모로 검출하기 위한 빠르고 효율적인 방법의 필요성을 조성했습니다. 구체적으로, CRISPR 가이드 RNA(gRNA)/Cas9 매개 비균성 최종 결합(NHEJ)에 의해 생성된 유전자 편집 부위에서 삽입 및 삭제(indels)를 검출하는 것은 돌연변이 발생의 충실도 및 의도하지 않은 변화의 빈도를 평가하는 데 중요하다. 우리는 여기에 높은 처리량 NHEJ 분석에 적합한 디지털 물방울 PCR (ddPCR)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 메서드는 개별 서열 변동을 식별하는 데이터를 생성하지 는 않지만 모집단 내의 시퀀스 변동에 대한 정량적 추정을 제공합니다. 또한 적절한 리소스를 통해 이 프로토콜은 차세대 또는 Sanger 시퀀싱보다 더 쉽게 현장 실험실 설정에서 구현할 수 있습니다. ddPCR은 또한 유전 으로 조작 된 유기체의 현장 시험 동안 야생 인구의 유전 적 변이에 대한 보다 빠르고 완전한 분석을 허용하는 그 방법 중 하나보다 결과에 대한 빠른 회전 시간을 가지고 있습니다.
Introduction
유전자 드라이브는 의료 및 농업관련성1,2,3,4,5의곤충 인구를 제어 할 수있는 엄청난 잠재력을 갖는다. 예를 들어, CRISPR Cas 뉴클레아제 및 가이드 RNA(gRNA)를 기반으로 한 유전자 구동 시스템은 말라리아 기생충에 내화성을 부여하는 특성을 도입하여 벡터 모기 집단을 수정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 감소된 투과및 적은질환으로이어지는1,4,5. 유전자 구동 시스템은 전 메이오성 세균 세포에서 한 동종 염색체에서 다른 것으로 분리된 특성을 복사하며, 이것은 자손의 대다수가 드라이브를 상속하고 현장에서 오래 지속되고 지속 가능한 인구 수정의 잠재력을 창출할 수 있도록 합니다. 그러나, Cas/gRNA 기반 방법의 한 가지 단점은 비동상화 최종 결합(NHEJ) DNA 수리를 통해 삽입 및 삭제(indel) 돌연변이를 생성할 수 있다는 점이며, 그 결과 인구에서 충분히 높은 주파수로 축적될 때,구동시스템이1,2,3,4, 4의 확산으로부터 구동 시스템을 멈출 수 있다는것입니다. . 이 프로토콜은 Cas/gRNA 기반 유전자 드라이브 동안 인구 및 개별 수준에서 인델 돌연변이의 보급및 상대적 양을 결정할 수 있는 높은 처리량 및 신뢰할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다.
차세대 시퀀싱(NGS) 메서드는 비교할 수 없는 시퀀싱 해상도를 제공합니다. 그러나 NGS와 관련된 비용 및 기술적 요구 사항은 일상적인 테스트를 금지하고 인델6,7,8을평가하는 고처리량 방법으로 사용을 제한합니다. 전통적인 PCR 정량화 방법은 오랫동안 게놈 인델에 대한 표준 평가 절차로 사용되어 왔습니다. 그러나 이러한 방법은 노동 집약적이며 데이터를 조달하는 데 시간이 오래 걸리며 변동성이 높습니다. 디지털-물방울 PCR(ddPCR)은 일부 응용 분야에서 Sanger 시퀀싱보다 돌연변이 검출시 더 민감하다는 것이 입증되었으며, 그 외6,7,8,9에서NGS보다 검출 한계가 낮다. 더욱이, 결과를 얻기 위한 샘플 세트 및 턴어라운드 시간을 평가하는 비용은 Sanger 시퀀싱 또는 NGS9보다ddPCR에 대해 각각 비용이 적게 들고 빠릅니다. 드롭오프 분석은 이중 프로브 시스템을 사용하여 gRNA 지향 대상 Cas9 절단 부위에 야생 유형(WT) 서열이 없는 것을 기반으로 NHEJ 대립유전자를 식별합니다. 이 분석에서, Cas/gRNA 계열 시스템의 예측컷 부위를 포함하는 짧은 앰플리시온이 특정 프라이머 쌍으로 증폭된다. 하나의 형광 프로브는 앰플리콘의 보존 된 영역에 결합하도록 설계되고 다른 형광 프로브는 절단 부위의 WT 서열을 인식합니다. NHEJ 본선이 있을 때 후자는 앰플리턴에 결합하지 않습니다.
ddPCR의 사용은 모기 인구 분석9에서NHEJ 프로파일링을 허용하는 삭제, 단일 염자 쌍 차이 및 삽입을 대상으로 프라이머를 설계할 수 있는 기능을 제공한다. 이러한 매력적인 특징을 감안할 때, 우리는 모기에 있는 Cas/gRNA 기지를 둔 유전자 드라이브 시스템에서 생성된 indels의 높은 처리량 검출을 위한 ddPCR를 위한 프로토콜을 만들었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
디지털 물방울 PCR은 Cas/gRNA 기반 유전자 구동 시스템에서 NHEJ 이벤트로 인한 인델 알레일의 존재를 결정하고 개인 또는 인구에서 이러한 알레일의 주파수를 정량화할 수 있는 효율적인 방법입니다. 프로토콜의 몇 가지 단계는 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다. 첫째, 게놈 DNA 추출은 고품질과 충분한 양을 보장하기 위해 신중하게 수행되어야 합니다. 좋은 추출은 반응 당 haploid 게놈 사본의 정확한 결정을 허용할 것입니다. 우리의 경험에 따르면, 상용 키트 (재료의 표참조) 지속적으로 고품질의 DNA 추출을 제공. 그러나 DNA 펠릿이 시각화하기 어려워지고 주의하지 않으면 상체로 쉽게 빨려 들어올릴 수 있기 때문에 개별 모기의 추출은 특히 어려울 수 있습니다. 둘째, 프라이머와 프로브는 신중하게 설계되어야 합니다. ddPCR 실험을 완료하기 전에 설계된 프라이머가 먼저 기존 PCR을 수행하고 젤 전기포진을 통해 단일 제품을 시각화하여 단일 PCR 제품이 생성되도록 하십시오. 또한 참조 FAM 프로브는 매우 보존된 시퀀스에 보완되도록 설계되어야 합니다. 이를 통해 다양한 인구에 걸쳐 WT 알레를 정확하게 감지할 수 있습니다. 각 고유한 실험에 대한 프라이머/프로브 조합은 서로 다른 열사이클러 조건을 가지며 열 그라데이션을 사용하여 이러한 조건을 최적화하는 것이 좋습니다.
Sanger 시퀀싱 또는 NGS와 같은 인델을 식별하는 다른 방법이 존재합니다. Sanger 시퀀싱은 검출 의 하한과 새로운 변종을 식별하기 위해 낮은 발견 전력을 가지고 있기 때문에 제한됩니다. Sanger 시퀀싱도 노동 집약적이며 높은 처리량이 아닙니다. Sanger 시퀀싱과 비교하여 NGS는 낮은 감도, 검색 전력 및 처리량의 동일한 제한이 없습니다. NGS의 또 다른 이점은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)에서 재배열에 이르기까지 다양한 돌연변이를 검출하는 능력입니다. 그러나 NGS는 관심 영역이 하나뿐이기 때문에 Cas9/gRNA 관련 인델을 결정하는 적용시 더 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 방법이며, 더 큰 게놈 전체 분석에 가장 적합합니다. 앞서 언급한 방법에 비해 ddPCR은 처리량이 높으며 빠른 턴어라운드 시간을 갖는다. ddPCR 재료 및 계측기가 사내에서 사용할 수 있는 경우, 96개의 샘플을 1-2일 이내에 처리할 수 있어 Cas9/gRNA-변형 생물의 대규모 실험에 대한 빠른 분석에 적합합니다.
ddPCR에 대한 많은 이점이 존재하지만 제한사항도 있습니다. 첫째, ddPCR 장비는 독립적인 실험실 환경에서는 자주 사용할 수 없습니다. ddPCR 장비는 대규모 연구 기관에서 공동으로 사용할 수 있지만 기관 외부에서 데이터 생성 및 분석이 용이하지는 않습니다. 둘째, 대안과 달리, ddPCR은 확인된 인델 돌연변이의 개별 고유 서열을 제공하지 않는다. 디지털 물방울 PCR은 인구 내에서 인델 돌연변이의 주파수를 제공하지만, 서열없이, 존재하는 인델이 관심있는 유전자의 기능을 보존하거나 억제 할 가능성이 있는지 여부를 결정할 수 없습니다. ddPCR 방법은 아마도 Cas9/gRNA 기반 드라이브 유기체의 현장 방출 시험 후 야생 인구를 분석하는 것이 가장 적합하기 때문에 원모로 의 전환유전자도입 빈도와 인구 내의 인델 생성을 실시간으로 효율적으로 결정할 수 있기 때문이다. ddPCR빠른 턴어라운드 시간으로 인해 재료가 로컬로 제공되는 경우 매주 현장 시험 지역에서 샘플링을 수행하고 인구를 분석하는 것이 가능할 것입니다. ddPCR 장비를 구입, 수입 및 설정하는 시동 비용은 원격 실험실에서 높지만 드라이브 시스템에서 수정을 받고 있으므로 야생 인구를 엄격하게 평가할 수 있다는 이점은 비용을 정당화할 수 있습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기금은 캘리포니아 어바인 말라리아 이니셔티브의 대학에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
Referenzen
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