Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae
Summary
Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.
Abstract
Las técnicas de microinyección embrionaria son esenciales para muchos estudios moleculares y genéticos de especies de insectos. Proporcionan un medio para introducir fragmentos de ADN exógenos que codifican genes de interés, así como rasgos favorables en la línea germinal de insectos de una manera estable y heredable. Las cepas transgénicas resultantes pueden estudiarse para detectar cambios fenotípicos resultantes de la expresión del ADN integrado para responder a preguntas básicas o utilizarse en aplicaciones prácticas. Aunque la tecnología es sencilla, requiere del investigador paciencia y práctica para lograr un nivel de habilidad que maximice la eficiencia. Aquí se muestra un método para la microinyección de embriones del mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae. El objetivo es entregar por microinyección ADN exógeno al embrión para que pueda ser absorbido en las células germinales (polos) en desarrollo. La expresión del ADN inyectado de transposasas, integrasas, recombinasas u otras nucleasas (por ejemplo, proteínas asociadas a CRISPR, Cas) puede desencadenar eventos que conducen a su inserción covalente en los cromosomas. An. gambiae transgénico generado a partir de estas tecnologías se han utilizado para estudios básicos de componentes del sistema inmunológico, genes involucrados en la alimentación sanguínea y elementos del sistema olfativo. Además, estas técnicas se han utilizado para producir cepas de An. gambiae con rasgos que pueden ayudar a controlar la transmisión de parásitos de la malaria.
Introduction
Las técnicas de microinyección se han utilizado para manipular experimentalmente organismos desde principios de 19001. La microinyección se ha utilizado para estudiar tanto las funciones biológicas básicas como para introducir cambios importantes en la biología de un organismo deseado. La técnica de microinyección ha sido de particular interés para los biólogos vectoriales y ha sido ampliamente utilizada para manipular genomas vectoriales2-11. Los experimentos de transgénesis en vectores de artrópodos a menudo tienen como objetivo hacer que los vectores sean menos eficientes en la transmisión de patógenos al promulgar cambios que disminuyen la aptitud de un vector o aumentan la refractariedad a los patógenos que transmiten. Los mosquitos transmiten una variedad de patógenos humanos y tienen un impacto significativo en la morbilidad y la mortalidad en todo el mundo. El género de mosquitos Anopheles transmite los patógenos parásitos de la malaria humana, Plasmodium spp. Los experimentos de ingeniería genética con Anopheles han tenido como objetivo comprender mejor la biología y reducir la capacidad vectorial de estos mosquitos en los esfuerzos por desarrollar nuevas estrategias de eliminación de la malaria.
Los mosquitos vectores que contribuyen con la mayor cantidad de infecciones de malaria en todo el mundo se encuentran en el complejo de especies anopheles gambiae. Sin embargo, la mayoría de los experimentos exitosos de transgénesis se han realizado en el vector de la malaria del subcontinente indio, Anopheles stephensi. Si bien existen muchas cepas de Anopheles gambiae adaptadas al laboratorio, el número de líneas transgénicas de Anopheles gambiae spp. reportadas en la literatura no se compara con el de Anopheles stephensi. Se cree que el embrión de Anopheles gambiae es más difícil de inyectar y lograr una transgénesis exitosa que Anopheles stephensi,aunque se desconocen las razones de estas diferencias. Este protocolo describe un método que ha demostrado ser consistentemente exitoso en el logro de la transgénesis de embriones de Anopheles gambiae a través de la microinyección. El protocolo se basa en un método previamente desarrollado por Hervé Bossin y Mark Benedict12 con algunos detalles adicionales y alteraciones añadidas que se han encontrado para aumentar la eficiencia de la transgénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la mayor disponibilidad de tecnologías de ingeniería genética precisas y flexibles como CRISPR/Cas9, los organismos transgénicos pueden desarrollarse de una manera más directa y estable de lo que era posible anteriormente. Estas herramientas han permitido a los investigadores crear cepas transgénicas de mosquitos vectores que están muy cerca de lograr las propiedades deseadas de refractariedad a patógenos (modificación de la población) o esterilidad hereditaria (supresión de la población). Sin embargo, pa…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell y Madeline Nottoli por la cría de mosquitos. La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria de la Universidad de California, Irvine. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Referenzen
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
