Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae
Summary
Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.
Abstract
Le tecniche di microiniezione degli embrioni sono essenziali per molti studi molecolari e genetici sulle specie di insetti. Forniscono un mezzo per introdurre frammenti di DNA esogeni che codificano geni di interesse e tratti favorevoli nella linea germinale degli insetti in modo stabile ed ereditabile. I ceppi transgenici risultanti possono essere studiati per i cambiamenti fenotipici derivanti dall’espressione del DNA integrato per rispondere a domande di base o utilizzati in applicazioni pratiche. Sebbene la tecnologia sia semplice, richiede all’investigatore pazienza e pratica per raggiungere un livello di abilità che massimizzi l’efficienza. Mostrato qui è un metodo per la microiniezione di embrioni della zanzara africana della malaria, Anopheles gambiae. L’obiettivo è quello di fornire per microiniezione DNA esogeno all’embrione in modo che possa essere assorbito nelle cellule germinali (polo) in via di sviluppo. L’espressione dal DNA iniettato di trasposasi, integrasi, ricombinasi o altre nucleasi (ad esempio proteine associate a CRISPR, Cas) può innescare eventi che portano al suo inserimento covalente nei cromosomi. Transgenic An. gambiae generato da queste tecnologie sono stati utilizzati per studi di base di componenti del sistema immunitario, geni coinvolti nell’alimentazione del sangue ed elementi del sistema olfattivo. Inoltre, queste tecniche sono state utilizzate per produrre ceppi di An. gambiae con tratti che possono aiutare a controllare la trasmissione dei parassiti della malaria.
Introduction
Le tecniche di microiniezione sono state utilizzate per manipolare sperimentalmente gli organismi fin dai primi anni del 19001. La microiniezione è stata utilizzata per studiare sia le funzioni biologiche di base che per introdurre importanti cambiamenti nella biologia di un organismo desiderato. La tecnica di microiniezione è stata di particolare interesse per i biologi vettori ed è stata ampiamente utilizzata per manipolare i genomi vettoriali2-11. Gli esperimenti di transgenesi nei vettori di artropodi spesso mirano a rendere i vettori meno efficienti nella trasmissione di agenti patogeni attuando cambiamenti che diminuiscono l’idoneità di un vettore o aumentano la refrattarietà ai patogeni che trasmettono. Le zanzare trasmettono una varietà di agenti patogeni umani e hanno un impatto significativo sulla morbilità e sulla mortalità in tutto il mondo. Il genere Anopheles di zanzare trasmette i patogeni parassiti della malaria umana, Plasmodium spp. Gli esperimenti di ingegneria genetica con Anopheles hanno mirato a comprendere meglio la biologia e ridurre la capacità vettoriale di queste zanzare negli sforzi per sviluppare nuove strategie di eliminazione della malaria.
I vettori di zanzare che contribuiscono alla maggior parte delle infezioni da malaria in tutto il mondo si trovano nel complesso delle specie Anopheles gambiae. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti di transgenesi di successo sono stati eseguiti sul vettore della malaria del subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Mentre esistono molti ceppi di Anopheles gambiae adattati in laboratorio, il numero di linee transgeniche di Anopheles gambiae spp. riportate in letteratura non è paragonabile a quello di Anopheles stephensi. Si pensa che l’embrione di Anopheles gambiae sia più difficile da iniettare e ottenere una transgenesi di successo rispetto ad Anopheles stephensi, sebbene le ragioni di queste differenze siano sconosciute. Questo protocollo descrive un metodo che ha dimostrato di avere costantemente successo nel raggiungere la transgenesi degli embrioni di Anopheles gambiae tramite microiniezione. Il protocollo si basa su un metodo precedentemente sviluppato da Hervé Bossin e Mark Benedict12 con alcuni dettagli aggiuntivi e modifiche aggiunte che sono state trovate per aumentare l’efficienza della transgenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la maggiore disponibilità di tecnologie di ingegneria genetica precise e flessibili come CRISPR / Cas9, gli organismi transgenici possono essere sviluppati in modo più semplice e stabile di quanto fosse possibile in precedenza. Questi strumenti hanno permesso ai ricercatori di creare ceppi transgenici di vettori di zanzare che sono molto vicini a raggiungere le proprietà desiderate di refrattarietà ai patogeni (modifica della popolazione) o sterilità ereditaria (soppressione della popolazione). Tuttavia, per svi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli per l’allevamento delle zanzare. Il finanziamento è stato fornito dall’Università della California, Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l’Università della California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Referenzen
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