珠子加载将蛋白质、质粒和颗粒引入粘附的哺乳动物细胞。这种细胞加载技术价格低廉、速度快,不会对细胞健康产生重大影响。它最适合活细胞成像。
许多活细胞成像实验使用外源粒子(例如肽、抗体、珠子)在细胞内标记或发挥作用。然而,将蛋白质引入细胞膜是很困难的。现有方法的选择有限,效率低下,需要昂贵和技术要求高的设备,或在狭窄的参数内工作。在这里,我们描述了一种相对简单且经济高效的技术,用于将DNA、RNA和蛋白质加载到活的人类细胞中。珠子加载会诱发细胞膜的暂时机械中断,使大分子进入粘附的活哺乳动物细胞。每次实验的珠子加载成本低于 0.01 美元,是可用成本最低的电池加载方法。此外,珠子加载不会对细胞造成实质性压力或影响其生存能力或增殖。本文稿描述了珠子装载过程的步骤、适应、变化和技术限制。这种方法特别适用于活细胞成像,但为需要将蛋白质、珠子、RNA 或质粒引入活体、粘附哺乳动物细胞的其他应用提供了实用的解决方案。
将大分子加载到哺乳动物细胞中需要方法,使它们能够穿过细胞的血浆膜1。几种方法可以通过转染将质粒引入哺乳动物细胞,包括脂质转染2 和脂肪乙基-德克斯特拉转染3。然而,将蛋白质或膜不透水颗粒加载到细胞中的方法更为有限。
一些技术已经绕过了这一困难的障碍,采用了各种策略。首先,显微投射通过微管将粒子送入显微镜4下的活细胞。虽然可以说是最可控和侵入性最小的方法,但这种技术的吞吐量相对较低,因为必须逐个加载细胞。此外,微投射需要专门的设备,而且技术要求很高。
其次,电电是一种通过电压诱导膜中断5、6、7将蛋白质电注入细胞的方法。然而,这种方法再次需要专门的,昂贵的设备,冲击可能会导致细胞压力和死亡。此外,细胞必须在电镀前尝试化,然后重新镀放,从而限制了电聚后细胞被调查的时间范围。
第三,细胞膜可以化学改性为临时的,可逆渗透8,9。链霉素-O加载将内毒素插入细胞膜,形成临时毛孔,允许外源膜不透水颗粒,包括蛋白质和DNA质粒,进入细胞10。经过2小时的恢复,大约一半的细胞修复这些毛孔,并停止从溶液内化颗粒。然而,这种技术需要很长的恢复时间,与不能容忍内毒素的细胞类型不相容。
第四,机械干扰通过细胞膜11的物理扰动将粒子加载到细胞中。这可以通过多种方式完成,包括刮伤,刮伤和滚动珠子在细胞12,13。早在1987年,珠子就被用来机械地将蛋白质加载到细胞中。最近,珠子加载技术经过优化和调整,超越蛋白质,包括质粒和RNA的加载,如这里所述。
珠子加载是一种简单、廉价和快速的方法,用于将蛋白质和质粒加载到粘附的人体细胞中。玻璃珠在细胞上短暂滚动,暂时破坏其细胞膜。这允许溶液中的粒子进入。由于珠子加载效率低,最适合单分子或单细胞显微镜实验。珠子加载可以引入各种各样的蛋白质,包括碎片抗体(Fab),15,16纯化蛋白,如scFvs,17体内,18,19,或mRNA涂层蛋白,例如MS2涂层蛋白(MCP)20,21。普拉斯米德表达载体也可以添加到蛋白质溶液和珠子同时加载22,23,24,25。
除了蛋白质和质粒,250纳米聚苯乙烯珠的分子通过珠子加载(个人交流)被引入细胞。珠子装载成本非常低廉,每次材料实验成本不到 0.01 美元,无需额外的昂贵设备。通过尽量减少每个实验使用的探头数量,成本进一步降低,因为只有图像室中央直径为 14 mm 直径的微井中的细胞被加载。需要注意的是,有限的装载区域意味着珠子装载不适合散装电池装载。
本文稿介绍了珠子装载过程,包括如何构建珠子装载装置并进行实验。结果表明,蛋白质、RNA和DNA可以加载到不同的细胞类型中,同时携带两种不同的珠子加载蛋白质具有高度相关细胞浓度和相对较低的差异。还讨论了基于细胞类型和蛋白质、质粒或RNA的载量的协议变化。虽然珠子被认为穿孔和破坏细胞膜,当适当执行时,珠子加载过程只会将少量细胞从成像室底部移出。经过短暂的恢复期后,细胞继续生长和分裂。这种方法非常适合活细胞显微镜实验,包括单分子蛋白和RNA跟踪、转化后修饰检测、动态细胞机制观察或亚细胞定位监测15、16、22、26、27。
此处描述的珠子加载技术是将大分子和其他粒子引入粘附细胞的成本效益和时间效益好的方法。这种多功能工艺可以加载蛋白质(图2A)15,16,26,27,蛋白质和质粒(图2B,C)22,25,RNA(图4C),100和250纳米聚苯乙烯珠(个人通信),合成染料39或量子点34,40 .珠子加载可能也有能力加载其他类型的膜防渗颗粒。其最常用的应用是将抗体或 Fabs 加载到活细胞中,以瞄准内源性表位,如转化后修饰 (PTMs)。目标,如PTM,往往很难标记在活细胞没有建立PTM特定的,基因编码探头41,42。相比之下,珠子加载可以将多种类型的探针、记者或其他分子工具一起引入同一个细胞,以便同时监测多个读数。我们预计珠子加载将是装载各种大分子或颗粒的有用技术。
珠子加载的一个主要优点是成本低:每个实验的成本低于0.01美元。珠子装载机设备可以轻松使用总成本为 150 英镑(合 150 美元)的廉价材料制造,这比任何其他电池装载方法都便宜得多。通过用塑料设备替换可重复使用的金属室,珠子装载机设备的成本可以进一步降低到 10 美元以下。为此,要么在 35 mm 的腔室中钻一个洞,要么从 35 mm 的玻璃底室中取出玻璃,然后用胶带牢固地固定网格。代替设备,珠子加载甚至可以使用宽孔1000微升移液器尖端勺子和洒珠子到细胞上,虽然这种变化使得很难洒在细胞上的单层珠子(第4.6步)。
珠子加载的另一个好处是,细胞可以保持正常的整体形态,快速恢复,并继续生长和分裂,至少对于在这里研究的U2OS、RPE1和 HeLa细胞,以及其他地方研究的其他细胞系(图3)图4A,B:补充视频1;和表1)31。在珠子加载过程中,细胞会承受物理压力,有时会脱落和剥落(在最佳条件下,5% 的细胞剥落,但如果珠子加载过于有力或在细胞上加载太多的玻璃珠(如图 3B所示),则可能会发生更大的细胞损失。然而,仍然附着在盖唇上的珠子加载细胞通常看起来健康,在珠子加载后30分钟(图3A)即可成像。我们通常允许细胞有30分钟的恢复期,但预计在珠子加载后更早成像是可行的。
这种技术的一个主要缺点是,细胞需要能够承受加载过程中轻微的身体压力,并保持安全地粘附在覆盖唇上。在涂层板(例如 HEK 和干细胞)上生长的不良/非粘附细胞系或细胞在珠子加载过程中经常在轻敲时分离。此外,经验表明,原发性神经元对珠子加载过于敏感。
珠子加载最适合单细胞或单分子实验。根据我们的经验,珠子加载具有大约20-40%的蛋白质加载效率,而+20%的珠子加载细胞也表达了共同加载质粒(图2A,B)。因此,珠子加载质粒对蛋白质表达的效率可能不如珠子加载纯化蛋白,因为质粒不仅必须进入细胞,而且必须表达(这涉及核导入、转录和翻译,每个都可能降低表达效率)。珠装质粒表达的低效率可以通过使用替代的转染协议,如脂化,在珠子加载蛋白质或探针16,27之前绕过。此外,在珠子加载前在最佳介质中孵育细胞30分钟可能有助于质粒表达。由于质粒表达率低,在这个实验室中,珠子加载并不经常被用作基于脂质的转染的替代品。唯一的例外是,当纯化蛋白,如Fab,是共同加载,在这种情况下,它是相当方便的珠子加载蛋白质和质粒在同一时间。此外,对于对脂质感染反应迟钝或不耐受的细胞,珠子加载可能为瞬态质粒表达提供替代方法,尽管效率低下。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢斯塔塞维奇实验室的成员进行了无数次对话,帮助改进和发展了本协议。具体来说,琳达·福雷罗博士和菲尔·福克斯博士就珠子加载不同细胞类型提供建议。我们衷心感谢横须贺博士、佐藤裕子博士和木村弘治博士分享了他们的玻璃珠装货协议。我们非常感谢阿肖克·普拉萨德博士和迭戈·克拉普夫博士慷慨地分享他们的珠子加载协议,将无机粒子引入细胞。我们感谢特拉维斯·桑德斯博士、克雷格·马歇尔博士和托马斯·桑坦杰洛博士慷慨地分享了他们标有RNA试剂。ALK、MNS、CAC、GG 和 TJS 得到了国家卫生研究院 (NIH) 授予 R35GM119728 和国家科学基金会 (NSF) 职业补助金 MCB-1845761 的支持,这两者都用于 TJS。CAC 还获得了 NSF NRT 奖 DGE-1450032 的支持。
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |