グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン
Summary
ここでは、EMBLグルノーブルのHTX研究所でCrystalDirect技術に基づくタンパク質から構造への自動高分子結晶学パイプラインの使用方法、迅速なリガンド-タンパク質複合体分析、大規模なフラグメントスクリーニングの方法について説明します。
Abstract
EMBLグルノーブルは、世界中のユーザーに高スループットの結晶学サービスを提供する大規模なユーザー施設であるハイスループット結晶化研究所(HTX Lab)を運営しています。HTXラボは、高分子結晶学の新しい方法の開発に重点を置いています。高スループットの結晶化プラットフォーム、完全に自動化された結晶実装と凍結冷却のためのCrystalDirect技術、およびCRIMSソフトウェアを組み合わせて、インターネット上でリモート操作できる高分子結晶学用の完全自動化パイプラインを開発しました。これには、新しい構造の決定のためのタンパク質から構造へのパイプライン、薬用化学をサポートするタンパクリガンド複合体の迅速な特徴付けのためのパイプライン、1000以上の断片のライブラリの評価を可能にする大規模で自動化された断片スクリーニングパイプラインが含まれます。ここでは、これらのリソースにアクセスして使用する方法について説明します。
Introduction
結晶化から回折データ収集、処理1、2、3、4、5、6、7、8、9、サンプル取り付け10、11、12のための多くの技術を含む、高分子結晶学実験プロセスのすべてのステップで自動化が導入されています。 、13,14,15,16,17.これは、結晶構造が得られるペースを加速させただけでなく、構造ガイド付き薬物設計18、19、20、21、23、24のようなアプリケーションを合理化するのに貢献しています。本稿では、グルノーブルのHTXラボで利用可能な自動結晶学パイプラインの側面と基礎技術について説明します。
EMBLグルノーブルのHTXラボは、ヨーロッパで結晶化スクリーニングのための最大の学術施設の一つです。欧州フォトンと中性子(EPN)キャンパスに、世界で最も華麗なX線ビームの一部を生産する欧州放射光施設(ESRF)と高流束中性子ビームを提供するラウ・ランゲヴィン研究所(ILL)と共同で配置されています。2003年に操業開始以来、HTXラボは800人以上の科学者にサービスを提供し、年間1000以上のサンプルを処理しています。HTXラボは、サンプル評価と品質管理25、26およびCrystalDirect技術を含む高分子結晶学の新しい方法の開発に重点を置いており、完全に自動化された結晶取り付けおよび処理15、16、17を可能にする。また、HTXラボでは、結晶化とシンクロトロンデータ収集施設の間の自動通信を提供するウェブベースのラボ情報システムである結晶学情報管理システム(CRIMS)を開発し、純粋なタンパク質から回折データまでのサンプルサイクル全体で途切れない情報フローを可能にしました。HTX施設、CrystalDirect技術、CRIMSソフトウェアの能力を組み合わせて、結晶化スクリーニング、結晶最適化、自動結晶収穫処理、凍結冷却およびX線データ収集を統合した完全自動化されたタンパク質間パイプラインを開発し、複数のシンクロトロンでのデータ収集を、ウェブブラウザを介してリモート操作できる単一かつ連続的なワークフローに移行しました。これらのパイプラインは、新しい構造の迅速な決定、タンパクリガンド複合体の特徴付け、X線結晶学による大規模化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートするために適用することができます。
HTXラボには、非体積結晶化ロボット(可溶性タンパク質と膜タンパク質の両方の結晶化を可能にするLCPモジュールを含む)、結晶農場(5°Cと20°C)、結晶化スクリーンを準備する2つのロボット液体処理ステーション、および操作サイクルごとに最大400個の凍結サンプルピンを製造および保存する能力を持つ2つの自動CrystalDirectクリスタルハーベスタが装備されています。科学者は、エクスプレス宅配便で施設にサンプルを送り、HTXラボの専任技術者によって処理されます。科学者はCRIMSシステムによって提供されるWebインターフェイスを通して、結晶化スクリーニングおよび最適化実験を遠隔設計することができる。このインターフェースを通じて、彼らは、特定のサンプル要件に合わせて施設で利用可能な幅広いパラメータと実験プロトコルから選択することができます。結果とすべての実験パラメータは、CRIMSを通じてリアルタイムでユーザーに提供されます。受け取ったすべてのサンプルは、サンプル25、26、27の結晶化可能性を推定することを可能にする具体的に開発された方法を通じてアッセイされる。このアッセイの結果に基づいて、最適なインキュベーション温度および可能なサンプル最適化実験に関するユーザーに対して特定の推奨事項がなされる。結晶化実験を設定すると、科学者はウェブを通して異なる時点で収集された結晶化画像を見て結果を評価することができます。X線回折実験に適した結晶が特定されると、科学者は専用のインターフェースを使用してクリスタルマウント計画を立て、CrystalDirectロボットによって実行されます。
CrystalDirect技術は、改変蒸気拡散結晶化マイクロプレートとレーザー光を使用して、結晶化とデータ収集15、16、17の間に存在するオートメーションギャップを埋める回折対応のサポートに、凍結冷却結晶サンプルを取り付ける技術に基づいている。簡単に言えば、結晶は、変更された蒸気拡散プレート、CrystalDirectマイクロプレートで成長します。結晶が現れたら、CrystalDirect収穫ロボットは自動的にレーザービームを適用して結晶を含むフィルム片を切除し、標準回折データ収集ピンに取り付け、窒素ガス流でクライオクールします(Zander et al. 2016および https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 参照)。この技術は手動または半自動の水晶取り付けプロトコルより多くの付加的な利点を有する。例えば、結晶の大きさや形状は問題ではなく、大きな結晶や微結晶を収穫しやすく、技術が動作する特別な方法(参照17、Zanderらら)のために、しばしば凍結保護剤の使用を避けることが可能であり、X線回折分析をより簡単にする。レーザービームは、例えば、結晶がクラスター上で成長したり、エピタキシャル成長を示すときにサンプルの最良の部分を選択するための外科用ツールとしても使用できます。CrystalDirect 技術は、自動浸漬実験17にも使用できます。小分子や他の化学物質を含む溶液を結晶に送り出す。これにより、完全に自動化された大規模な化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートすることができます。クリスタルが結晶を収穫し、CrystalDirectロボットによって凍結冷却されると、それらは世界中で最も同期的な高分子結晶性ビームラインと互換性のあるSPINEまたはユニパックパックのいずれかに移されます。システムは完全に自律的な方法で400ピン(極低温貯蔵デュワーの容量)まで収穫できる。CRIMSはプロセスの間に収穫機ロボットと通信し、結晶サンプル(パックおよびピン)の自動追跡を提供する。パックは、サンプル管理21、28を容易にするために、バーコードとRFIDタグの両方でマークされています。
CRIMSは、ヨーロッパと世界の多くのシンクロトロンでX線データ収集管理と処理をサポートするISPyBシステムとの自動通信をサポートするアプリケーションプログラムインタフェース(API)を提供します。自動結晶収穫が完了した後、科学者は、結晶サンプル(パック)を選択し、ESRF(グルノーブル、フランス)7、8、9またはペトラIIIシンクロトロン(ハンブルク、ドイツ)18、19のいずれかで高分子結晶学ビームラインのサンプル出荷を作成することができます。CRIMSは、選択されたビームラインサンプルに対応するデータを、事前に選択されたデータ収集パラメータとともにシンクロトロン情報システムに転送します。サンプルが選択したシンクロトロンビームラインに到着すると、X線データ収集は、リモートビームライン操作または完全に自動化された方法(すなわち、関節EMBL ESRF ESRFジョイント構造生物学グループ(JSBG)が操作するESRF8のMASSIF-1ビームラインで手動で行われます。データ収集後CRIMSは、シンクロトロンデータ処理システムによって行われた初期データ処理結果とともにデータ収集の結果に関する情報を自動的に取得し、便利なユーザーインターフェースを通じて科学者に提示する。
HTXラボは、これらの自動化されたパイプラインを適用して、3つの異なるアプリケーション、新しい構造の迅速な決定、タンパクリガンド複合体の迅速な特徴付け、大規模な化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートします。以下では、それらを使用して操作する方法を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する自動結晶学パイプラインは、さまざまな資金調達プログラムを通じて世界中の研究者が利用できます。現在、iNEXTディスカバリープログラムと「指示エリック」に適用することで、結晶化実験とCrystalDirect技術のための資金によるアクセスが可能であり、ESRFでの高分子結晶化ビームラインへのアクセスはESRFユーザーアクセスプログラムを通じてサポートされています。このアプローチは、結晶成長と測定の間の遅延を最小限に抑え、タンパク質産生と結晶化条件の回折ベースの最適化を必要とする非常に困難なプロジェクトの進行を加速し、結晶化、結晶処理およびビームライン操作に関連する複雑な操作から科学者を解放し、非専門家グループにとってよりアクセスしやすい結晶学をレンダリングします。また、結晶化添加剤、フェス化剤の迅速な探索、または共結晶化実験による化合物スクリーニングにも使用できます。ほとんどの結晶学プロジェクトはこのアプローチの恩恵を受ける可能性がありますが、一部のサンプルでは、マイクロ流体システムや高度に特殊化された結晶化装置、または非常に不安定で出荷を許容しないサンプルなど、ここで提示される自動化やパイプラインに適さない特別なプロトコルが必要な場合があります。
CrystalDirect技術は、小分子標的複合体の特性評価のために、自動結晶浸漬17も可能にします。このために、収穫プロセスの前にレーザーで小さな開口が作成され、所望の化学物質(すなわち、フェス化剤または潜在的なリガンド)を含む溶液の滴が上に加えられるので、それが接触して入り、最終的に結晶に到達する結晶化溶液に拡散する。化学溶液は、水、DMSOまたは他の有機溶媒で処方することができます。あるインキュベーション時間の後、結晶は、上記のように回折によって収穫され、分析することができる。このアプローチは、構造ベースの薬物設計の文脈におけるリガンド-タンパク質複合体の迅速な特性評価、ならびに大規模化合物およびフラグメントスクリーニングに適用されてきた。後者の場合、数百から1000以上のフラグメントを持つフラグメントライブラリを迅速に分析することができます。ここで紹介されていない特定のCRIMSインターフェイスは、クリスタルソーキング実験の設計と自動追跡を容易にし、グローバル・フェージング・リミテッド(英国)が開発したCRIMSソフトウェアとPipedreamソフトウェアスイートとの統合により、数百のデータセットにわたってデータ処理、フェージング、リガンドの同定、構造の細分化を並行して自動化し、データ分析と解釈を合理化する32,33.例えば、このパイプラインは最近、ヒトアフリカのトリパノソミア症を引き起こす寄生虫の重要な酵素である トリパノソーマ・ブルセイ ・ピロリン酸シンターゼの活性部位およびいくつかのアロステリック部位の両方に結合する断片の同定に適用された。
ここに示すパイプラインは、構造生物学における発見のペースを加速させ、より多くの研究グループが高分子結晶学をより利用しやすくするために貢献することができます。さらに、大規模な化合物やフラグメントスクリーニングを容易にすることで、翻訳研究の促進と創薬のプロセスのスピードアップに貢献し、より多くの標的に対するより良い、より安全な薬剤の開発を促進することに貢献します。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ESRF高分子ビームラインの使用と動作をサポートしてくれたEMBL-ESRF構造生物学グループ(JSBG)に感謝したいと思います。私たちは、ESRFとトーマス・シュナイダーのMASSIF-1ビームラインとEMBLハンブルクチームのデータ収集をサポートしてくれたマシュー・ボウラーに感謝しています。CrystalDirectの収穫機はEMBLグルノーブルのインストルメンテーションチームと共同で開発される。このプロジェクトは、ブースタープログラムを通じて、プロジェクトiNEXT(グラント・ノー・653706)とiNEXTディスカバリー(グラント・ノー・871037)とレジオン・オーヴェルニュ=ローヌ=アルプのプロジェクトの下で、欧州共同体H2020プログラムからの資金提供によって支えられました。
Materials
| CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
| CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
| Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
| Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
| Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
| Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
| UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
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