Rilevazione dell'anticorpo sars-CoV-2 Receptor-Binding Domain utilizzando un bioreporter basato su HiBiT

La recente comparsa di un nuovo coronavirus, SARS-CoV21, ha causato oltre 2.800.000 morti e 128 milioni di infezioni al ^{30 marzo} 20212. A causa della mancanza di una procedura di trattamento affidabile e consolidata per le terapie cliniche SARS-CoV-2, sono stati fatti molti sforzi per limitare l’ulteriore trasmissione virale e, cosa più importante, per sviluppare un trattamento efficace e robusto o un ^vaccino3. Ad oggi, ci sono più di 50 candidati vaccini COVID-19 in studi segnalati dall’Organizzazione Mondiale della ^Sanità4. Il rilevamento di anticorpi contro SARS-CoV-2 è di fondamentale importanza per determinare la stabilità a lungo termine della risposta umorale alla somministrazione del vaccino e nei pazienti guariti di COVID-195. Alcuni studi hanno dimostrato che esiste la possibilità che i pazienti con SARS-CoV-2 recuperati perdano la maggior parte degli anticorpi che legano RBD dopo 1 anno5,6,7,8,9. Sono necessarie ulteriori indagini per comprendere meglio l’immunità duratura e piattaforme di rilevamento degli anticorpi più sensibili possono aiutare ulteriormente tale lavoro. Anche le segnalazioni di immunità sostenuta di infezioni lievi da SARS-CoV-2, che suggeriscono risposte anticorpali a lungo termine, sono un’area di studio interessante e utile. Un metodo di rilevamento rapido e accurato è essenziale per il monitoraggio degli anticorpi nei sieri degli individui per fornire maggiori informazioni sull’immunità nella popolazione.

Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 utilizza la glicoproteina spike sporgente per legarsi all’enzima-2 di conversione dell’angiotensina (ACE2) per avviare una cascata di eventi che portano alla fusione delle membrane virali e ^cellulari6,7. Diversi studi hanno recentemente dimostrato che l’RBD della proteina Spike ha un ruolo cruciale nell’suscitare una risposta anticorpale potente e specifica contro SARS-CoV28,9,10,11. In particolare, le correlazioni osservate da Premkumar et al. tra il titolo dell’anticorpo legante RBD e la potenza di neutralizzazione sars-CoV-2 del plasma dei pazienti sono coerenti con RBD come compartimento immunogenico della struttura del ^virus9. Con questo in mente, molti test diagnostici disponibili per il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 richiedono tempo e costi, richiedono una lunga procedura di incubazione e lavaggio (saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA]) o mancano di sensibilità e accuratezza (saggio immunologico a flusso laterale [LFIA])¹². Pertanto, un metodo sierologico complementare quantitativo e rapido di rilevamento degli anticorpi derivati da COVID-19 con elevata sensibilità, risposta rapida e costo relativamente basso servirebbe alla necessità di un test sierologico affidabile per la sorveglianza epidemiologica sars-CoV-2.

Collettivamente, i limiti degli attuali saggi sierologici hanno spinto lo studio del sistema di segnalazione bioluminescente come potenziale agente diagnostico in future indagini sierosoratorie. La bioluminescenza è una reazione enzima/substrato naturale, con emissione luminosa. La nanoluc luciferasi è la più piccola (19 kDa), ma il sistema più luminoso rispetto alla Renilla e alla lucciola luciferasi (36 kDa e 61 kDa, rispettivamente)^13,14. Inoltre, Nanoluc ha il più alto rapporto segnale/rumore e stabilità tra i sistemi precedentemente menzionati. L’elevata intensità del segnale di Nanoluc supporta il rilevamento anche di quantità molto basse di fusioni di ^reporter15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) è una versione divisa del sistema Nanoluc, che è composto da due segmenti: piccolo BiT (11 amminoacidi; SmBiT) e BiT di grandi dimensioni (LgBiT) con interazioni di affinità relativamente bassa (_KD = 190 μM ) per formare un complesso ^{luminescente16}. NanoBiT è ampiamente utilizzato in vari studi che coinvolgono l’identificazione delle interazioni proteina-proteina15,17,18,19 e delle vie di segnalazione cellulare11,20,21.

Recentemente, è stato introdotto un altro piccolo peptide con un’affinità nettamente superiore a LgBiT (_KD = 0,7 nM ), vale a dire il sistema HiBiT Nano-Glo, al posto di SmBiT. L’alta affinità e il segnale forte del test Nano-Glo “add-mix-read” rendono HiBiT un tag peptidico adatto, quantitativo e luminescente. In questo approccio, il tag HiBiT viene aggiunto alla proteina bersaglio sviluppando un costrutto che impone interferenze strutturali minime. La fusione HiBiT-proteina si legherebbe attivamente alla controparte LgBiT, producendo un enzima luciferasi altamente attivo per generare bioluminescenza rilevabile in presenza di reagenti di rilevamento (Figura 1). Allo stesso modo, abbiamo sviluppato un sistema basato su HiBiT Nano-Glo per misurare prontamente il titolo anticorpale neutralizzante nei sieri di individui recuperati da SARS-CoV-2 e recentemente abbiamo sviluppato un RBD SARS-CoV-2 con tag HiBiT. Questo documento descrive il protocollo per la produzione del bioreporter HiBiT-RBD utilizzando procedure e apparecchiature di laboratorio standard e mostra come questo bioreporter può essere utilizzato in un test rapido ed efficiente per rilevare gli anticorpi mirati a SARS-CoV-2 RBD.