En generalisert metode for å bestemme gratis løselig fenolsyresammensetning og antioksidantkapasitet av korn og belgfrukter
Summary
Fenolsyrer er viktige fytokjemikalier som er tilstede i fullkorn. De har bioaktive egenskaper som antioksidantbeskyttende funksjoner. Dette arbeidet tar sikte på å rapportere om en generalisert metode for HPLC-identifisering, total fenolisk innholdsestimering og bestemmelse av antioksidantkapasiteten til fenolsyrer i korn og belgfrukter.
Abstract
Fenolsyrer er en klasse organiske forbindelser som bærer både en fenolgruppe og en karboksylgruppe. De finnes i korn og konsentrerer seg i kli av frokostblandinger eller frøbelegg av belgfrukter. De har antioksidantegenskaper som har generert mye forskningsinteresse de siste årene, om deres potensielle antioksidantbeskyttende helsefunksjoner. Dette arbeidet presenterer en generalisert metode for utvinning av frie oppløselige fenolsyrer fra fullkorn og analyse av deres antioksidantkapasitet. Fem fullkornsprøver bestående av to kornblandinger (hvete og gul mais) og tre belgfrukter (cowpea bønne, nyrebønner og soyabønner), ble brukt. Kornene ble malt i mel og deres frie oppløselige fenolsyrer ekstrahert ved hjelp av vandig metanol. Forbindelsene ble deretter identifisert ved hjelp av en høytrykks væskekromatografi (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden ble brukt til å bestemme deres totale fenoliske innhold mens deres antioksidantkapasitet ble bestemt ved hjelp av DPPH radikal scavenging kapasitet, Trolox tilsvarende antioksidant kapasitet (TEAC) og oksygen radikal absorbans kapasitet (ORAC) analyser. Fenolsyrene som ble identifisert inkluderte vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarinsyrer og ferulinsyrer. Vanillsyre ble identifisert bare i cowpea mens koffeinsyre ble identifisert bare i nyrebønner. p-coumarinsyre ble identifisert i gul mais, cowpea og soyabønne, mens ferulinsyre ble identifisert i alle prøvene. Ferulinsyre var den dominerende fenolsyren identifisert. Den totale konsentrasjonen av fenolsyrer i prøvene ble redusert i følgende rekkefølge: soyabønne > cowpea bønne > gul mais = nyrebønner > hvete. Den totale antioksidantkapasiteten (summen av verdier av DPPH, TEAC og ORAC analyser) redusert som følger: soyabønne > nyrebønne > gul mais = cowpea bønne > hvete. Denne studien konkluderte med at HPLC-analyse samt DPPH-, TEAC- og ORAC-analyser gir nyttig informasjon om fenolsyresammensetningen og antioksidantegenskapene til fullkorn.
Introduction
Fenolsyrer er blant de viktigste fytokjemikaliene som studeres i planter på grunn av den vitale rollen de spiller i planteforsvar mot plantelevende og soppinfeksjon, samt opprettholde strukturell støtte og integritet i plantevev 1,2. De er rikelig i kli av frokostblandinger og frøbelegg av belgfrukter3. Strukturelt er de delt inn i to grupper: hydroksybenzosyrene (figur 1) og hydroksycinnamic syrer (figur 2). De vanlige hydroksybenzosyrene i korn og belgfrukter inkluderer gallisk, p-hydroksybenzosyre, 2,4-dihydroksybenzosyre, protocatechuic, vanillic og syringssyrer, mens de vanlige hydroksycinnamic syrer inkluderer koffeinsyre, p-coumaric, ferulic og sinapic syrer3. Fenolsyrer har også antioksidantegenskaper siden de er i stand til å scavenge frie radikaler, noe som forårsaker oksidativ rancidity i fett, og initiere og forplante radikalt indusert oksidativt stress i fysiologiske systemer 4,5. På grunn av denne vitale fysiologiske rollen som antioksidanter, er de gjenstand for nyere forskning. Dette skyldes at når de forbrukes som komponenter av plantefôr, kan de utøve antioksidantbeskyttelse.
Korn og frokostblandinger er store karbohydratmatkilder for mennesker og dyr over hele verden6. Korn inkluderer hvete, ris, mais (mais), bygg, triticale, hirse og sorghum. Blant dem er mais mest utnyttet, med en estimert global utnyttelse på 1.135,7 millioner tonn i 2019/2020, etterfulgt av hvete med en estimert global utnyttelse på 757,5 millioner tonn i samme periode7. Kornmat er gode energikilder for forbrukerne siden de er rike kilder til karbohydrater. De gir også noe protein, fett, fiber, vitaminer og mineraler6. I tillegg til næringsverdien er korn gode kilder til fytokjemiske antioksidanter, spesielt fenolsyrer, som har potensial til å beskytte det fysiologiske systemet mot radikalindusert oksidativ skade3. Belgfrukter er også gode kilder til næringsstoffer og er generelt høyere i protein enn frokostblandinger. De inneholder også vitaminer og mineraler og brukes til fremstilling av ulike matvarer8. I tillegg er belgfrukter gode kilder til en rekke fytokjemiske antioksidanter, inkludert fenolsyrer, flavonoider, antocyaniner og proanthocyanidiner 9,10. Ulike varianter av frokostblandinger og belgfrukter kan ha en annen fenolsyresammensetning. Det er derfor behov for å studere fenolsyresammensetningen av korn og belgfrukter og deres varianter, for å vite deres potensielle helsemessige fordeler med hensyn til fenoliske antioksidanter.
En rekke analyser er rapportert for å måle mengden fenolsyrer i korn- og belgfruktkorn, og bestemme deres antioksidantaktiviteter. De vanligste analysemetodene for fullkorns fenolsyrer er spektrofotometri og flytende kromatografi11. Målet med dette arbeidet var å demonstrere en generalisert høytrykks væskekromatografisk metode for å bestemme fri løselig fenolsyresammensetning, og spektrofotometriske metoder for å bestemme totalt fenolinnhold og antioksidantkapasitet av noen fullkornskorn og belgfrukter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hele korn ble valgt som representative kornkorn og belgfrukter som finner brede matapplikasjoner over hele verden. Mens variasjoner kan eksistere blant kultivarer av hvert korn, var fokuset i denne studien å demonstrere en generalisert metode for fri fenolsyreutvinning og analyse for fullkorn. Utvinningsmetoden ble modifisert ved å redusere mengdene prøver og løsningsmidler betydelig, for å redusere mengden kjemikalier som ville bli frigjort i miljøet når slike eksperimenter utføres. Modifikasjonen muliggjør ogs…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner takknemlig den tekniske støtten til Ms. Alison Ser og Ms. Hannah Oduro-Obeng, samt videoredigeringsstøtten av Ms. Janice Fajardo og Mr. Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
Referenzen
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
