En generaliseret metode til bestemmelse af friopløselig phenolsyresammensætning og antioxidantkapacitet af korn og bælgfrugter
Summary
Fenolsyrer er vigtige fytokemikalier, der er til stede i fuldkorn. De besidder bioaktive egenskaber såsom antioxidantbeskyttende funktioner. Dette arbejde havde til formål at rapportere om en generaliseret metode til HPLC-identifikation, estimering af total phenolindhold og bestemmelse af antioxidantkapaciteten af phenolsyrer i korn og bælgfrugter.
Abstract
Phenolsyrer er en klasse af organiske forbindelser, der bærer både en phenolgruppe og en carboxylgruppe. De findes i korn og koncentreres i klid af korn eller frølag af bælgfrugter. De besidder antioxidantegenskaber, der har skabt stor forskningsinteresse i de senere år, om deres potentielle antioxidantbeskyttende sundhedsfunktioner. Dette arbejde præsenterer en generaliseret metode til ekstraktion af friopløselige phenolsyrer fra fuldkorn og analyse af deres antioxidantkapacitet. Fem fuldkornsprøver bestående af to korn (hvede og gul majs) og tre bælgfrugter (cowpea bønne, nyrebønne og sojabønne) blev anvendt. Kornene blev malet til mel og deres frit opløselige phenolsyrer ekstraheret ved hjælp af vandig methanol. Forbindelserne blev derefter identificeret ved anvendelse af en højtryksvæskekromatograf (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden blev brugt til at bestemme deres samlede phenolindhold, mens deres antioxidantkapacitet blev bestemt ved anvendelse af DPPH-radikalrensningskapaciteten, Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) og iltradikalusionskapacitet (ORAC) assays. De identificerede phenolsyrer omfattede vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarsyre og ferulinsyre. Vanillsyre blev kun identificeret i cowpea, mens koffeinsyre kun blev identificeret i nyrebønne. p-Coumarsyre blev identificeret i gul majs, cowpea og sojabønne, mens ferulinsyre blev identificeret i alle prøverne. Ferulinsyre var den fremherskende phenolsyre, der blev identificeret. Den samlede koncentration af phenolsyrer i prøverne faldt i følgende rækkefølge: sojabønne > cowpea bønne > gul majs = nyrebønne > hvede. Den samlede antioxidantkapacitet (summen af værdier af DPPH-, TEAC- og ORAC-assays) faldt som følger: sojabønne > nyrebønne > gul majs = cowpea bønne > hvede. Denne undersøgelse konkluderede, at HPLC-analyse såvel som DPPH-, TEAC- og ORAC-assays giver nyttige oplysninger om phenolsyresammensætningen og antioxidantegenskaberne af fuldkorn.
Introduction
Phenolsyrer er blandt de vigtigste fytokemikalier, der er undersøgt i planter på grund af den afgørende rolle, de spiller i planteforsvaret mod planteædende og svampeinfektion, samt opretholdelse af strukturel støtte og integritet i plantevæv 1,2. De er rigelige i klid af korn og frøbeklædning af bælgfrugter3. Strukturelt er de opdelt i to grupper: hydroxybenzoesyrer (figur 1) og hydroxycinnaminsyrer (figur 2). De almindelige hydroxybenzoesyrer i korn og bælgfrugter omfatter gallinsyre, p-hydroxybenzoesyre, 2,4-dihydroxybenzoesyre, protocatechuic, vanillic og syringinsyrer, mens de almindelige hydroxycinnaminsyrer omfatter koffeinsyre, p-coumarsyre, ferulsyre og sinapicsyrer3. Phenolsyrer besidder også antioxidantegenskaber, da de er i stand til at opsage frie radikaler, som forårsager oxidativ harskning i fedtstoffer, og initiere og udbrede radikal-induceret oxidativ stress i fysiologiske systemer 4,5. På grund af denne vitale fysiologiske rolle som antioxidanter er de genstand for nyere forskning. Dette skyldes, at når de indtages som komponenter i vegetabilske fødevarer, kan de udøve antioxidantbeskyttelse.
Korn og kornprodukter er vigtige kulhydratfødekilder for mennesker og dyr over hele verden6. Korn omfatter hvede, ris, majs (majs), byg, triticale, hirse og sorghum. Blandt dem er majs den mest anvendte med en anslået global udnyttelse på 1,135,7 millioner tons i 2019/2020, efterfulgt af hvede med en anslået global udnyttelse på 757,5 millioner tons i samme periode7. Kornfødevarer er gode energikilder til forbrugerne, da de er rige kilder til kulhydrater. De giver også noget protein, fedt, fiber, vitaminer og mineraler6. Ud over deres næringsværdi er korn gode kilder til fytokemiske antioxidanter, især phenolsyrer, som har potentiale til at beskytte det fysiologiske system mod radikalt induceret oxidativ skade3. Bælgfrugter er også gode kilder til næringsstoffer og er generelt højere i protein end korn. De indeholder også vitaminer og mineraler og bruges til fremstilling af forskellige fødevarer8. Derudover er bælgfrugter gode kilder til en række fytokemiske antioxidanter, herunder phenolsyrer, flavonoider, anthocyaniner og proanthocyanidiner 9,10. Forskellige sorter af korn og bælgfrugter kan have en anden phenolsyresammensætning. Der er derfor behov for at undersøge phenolsyresammensætningen af korn og bælgfrugter og deres sorter for at kende deres potentielle sundhedsmæssige fordele med hensyn til phenolantioxidanter.
Der er rapporteret om en række assays til måling af mængden af phenolsyrer i korn- og bælgfrugtkorn og bestemmelse af deres antioxidantaktiviteter. De mest almindelige analysemetoder for fuldkornsphenolsyrer er spektrofotometri og væskekromatografi11. Formålet med dette arbejde var at demonstrere en generaliseret højtryksvæskekromatografisk metode til bestemmelse af friopløselig phenolsyresammensætning og spektrofotometriske metoder til bestemmelse af totalt phenolindhold og antioxidantkapacitet i nogle fuldkornsprodukter og bælgfrugter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fuldkornene blev udvalgt som repræsentative kornkorn og bælgfrugter, der finder brede fødevareapplikationer over hele verden. Mens variationer kan eksistere blandt sorter af hvert korn, var fokus for denne undersøgelse at demonstrere en generaliseret metode til fri phenolsyreekstraktion og analyse for fuldkorn. Ekstraktionsmetoden blev modificeret ved væsentligt at reducere mængden af prøver og opløsningsmidler for at reducere mængden af kemikalier, der ville blive frigivet i miljøet, når sådanne eksperimente…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender taknemmeligt den tekniske støtte fra alison Ser og hannah Oduro-Obeng samt videoredigeringsstøtten fra fru Janice Fajardo og hr. Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
Referenzen
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
