En generaliserad metod för bestämning av frilöslig fenolsyrasammansättning och antioxidantkapacitet hos spannmål och baljväxter
Summary
Fenolsyror är viktiga fytokemikalier som finns i fullkorn. De har bioaktiva egenskaper som antioxidantskyddande funktioner. Detta arbete syftade till att rapportera om en generaliserad metod för HPLC-identifiering, uppskattning av totalt fenolinnehåll och bestämning av antioxidantkapaciteten hos fenolsyror i spannmål och baljväxter.
Abstract
Fenolsyror är en klass av organiska föreningar som bär både en fenolgrupp och en karboxylgrupp. De finns i korn och koncentreras i kli av spannmål eller fröbeläggning av baljväxter. De har antioxidantegenskaper som har genererat mycket forskningsintresse de senaste åren, om deras potentiella antioxidantskyddande hälsofunktioner. Detta arbete presenterar en generaliserad metod för extraktion av fria lösliga fenolsyror från fullkorn och analys av deras antioxidantkapacitet. Fem fullkornsprover bestående av två spannmål (vete och gul majs) och tre baljväxter (cowpeaböna, njurböna och sojabönor) användes. Kornen maldes till mjöl och deras fria lösliga fenolsyror extraherades med vattenhaltig metanol. Föreningarna identifierades sedan med hjälp av en högtrycksvätskekromatograf (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden användes för att bestämma deras totala fenolinnehåll medan deras antioxidantkapacitet bestämdes med hjälp av DPPH-radikalrensningskapaciteten, Trolox-ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) och syreradikalabsorberingskapacitet (ORAC) -analyser. De fenolsyror som identifierades inkluderade vanillinsyra, koffeinsyra, p-kumarinsyra och ferulinsyror. Vanillinsyra identifierades endast i cowpea medan koffeinsyra endast identifierades i njurböna. p-kumarinsyra identifierades i gul majs, cowpea och sojabönor, medan ferulinsyra identifierades i alla prover. Ferulinsyra var den dominerande fenolsyran som identifierades. Den totala koncentrationen av fenolsyror i proverna minskade i följande ordning: sojabönor > cowpeaböna > gul majs = njurböna > vete. Den totala antioxidantkapaciteten (summan av värdena för DPPH-, TEAC- och ORAC-analyser) minskade enligt följande: sojabönor > njurbönor > gul majs = cowpeaböna > vete. Denna studie drog slutsatsen att HPLC-analys samt DPPH-, TEAC- och ORAC-analyser ger användbar information om fenolsyrasammansättningen och antioxidantegenskaperna hos fullkorn.
Introduction
Fenolsyror är bland de viktigaste fytokemikalierna som studeras i växter på grund av den viktiga roll de spelar i växtförsvaret mot växtätande och svampinfektion, samt upprätthåller strukturellt stöd och integritet i växtvävnader 1,2. De är rikliga i kli av spannmål och fröbeläggning av baljväxter3. Strukturellt är de indelade i två grupper: hydroxibensoesyra (figur 1) och hydroxikinnaminsyror (figur 2). De vanliga hydroxibensoesyrorna i spannmål och baljväxter innefattar gallinsyra, p-hydroxibensoesyra, 2,4-dihydroxibensoesyra, protokatechuic, vanillinsyra och sprutsyror, medan de vanliga hydroxikinnaminsyrorna innefattar koffeinsyra, p-kumarsyra, ferulinsyra och sinapinsyror3. Fenolsyror har också antioxidantegenskaper eftersom de kan rensa fria radikaler, vilket orsakar oxidativ härskning i fetter och initierar och sprider radikalinducerad oxidativ stress i fysiologiska system 4,5. På grund av denna viktiga fysiologiska roll som antioxidanter är de föremål för ny forskning. Detta beror på att när de konsumeras som komponenter i vegetabiliska livsmedel kan de utöva antioxidantskydd.
Spannmål och spannmålsprodukter är viktiga kolhydratmatkällor för människor och djur över hela världen6. Spannmål inkluderar vete, ris, majs (majs), korn, triticale, hirs och sorghum. Bland dem är majs den mest utnyttjade, med ett uppskattat globalt utnyttjande på 1 135,7 miljoner ton 2019/2020, följt av vete med ett uppskattat globalt utnyttjande på 757,5 miljoner ton under samma period7. Spannmålsprodukter är bra energikällor för konsumenterna eftersom de är rika källor till kolhydrater. De ger också lite protein, fett, fiber, vitaminer och mineraler6. Förutom deras näringsvärde är spannmål goda källor till fytokemiska antioxidanter, särskilt fenolsyror, som har potential att skydda det fysiologiska systemet från radikalinducerad oxidativ skada3. Baljväxter är också bra källor till näringsämnen och är i allmänhet högre i protein än spannmål. De innehåller också vitaminer och mineraler och används vid framställning av olika livsmedel8. Dessutom är baljväxter bra källor till en mängd olika fytokemiska antioxidanter, inklusive fenolsyror, flavonoider, antocyaniner och proantocyanidiner 9,10. Olika sorter av spannmål och baljväxter kan ha en annan fenolsyrasammansättning. Det finns därför ett behov av att studera fenolsyrasammansättningen hos spannmål och baljväxter och deras sorter för att känna till deras potentiella hälsofördelar med avseende på fenolantioxidanter.
Ett antal analyser har rapporterats för att mäta mängden fenolsyror i spannmål och baljväxter och bestämma deras antioxidantaktiviteter. De vanligaste analysmetoderna för fullkornsfenolsyror är spektrofotometri och vätskekromatografi11. Syftet med detta arbete var att demonstrera en generaliserad vätskekromatografisk högtrycksmetod för bestämning av fritt löslig fenolsyrasammansättning och spektrofotometriska metoder för att bestämma totalt fenolinnehåll och antioxidantkapacitet hos vissa fullkornsspannmål och baljväxter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fullkornen valdes ut som representativa spannmålsprodukter och baljväxter som hittar breda livsmedelsapplikationer över hela världen. Medan variationer kan existera bland sorter av varje korn, var fokus för denna studie att visa en generaliserad metod för fri fenolsyraextraktion och analys för fullkorn. Extraktionsmetoden modifierades genom att avsevärt minska mängden prover och lösningsmedel för att minska mängden kemikalier som skulle släppas ut i miljön när sådana experiment utförs. Modifieringen möj…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt det tekniska stödet från Alison Ser och Hannah Oduro-Obeng, liksom videoredigeringsstödet från Janice Fajardo och Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
Referenzen
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
