Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) – Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)¹. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes². Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MRGPRX2 que foram superexpressos em células HEK. No estudo, a biblioteca de peptídeos foi construída utilizando-se técnicas simples e versáteis de escaneamento de alanina e truncação de aminoácidos. A varredura alanina envolve a substituição de aminoácidos específicos por um resíduo de alanina. Alanina sendo pequena e neutra, tira o peptídeo das propriedades específicas conferidas pelo resíduo substituído e destaca consecutivamente a significância das respectivas propriedades fisioquímicas do aminoácido nas interações receptoras. Pelo contrário, na truncação de aminoácidos, são projetadas sequências de peptídeos de tal forma que faltam um ou mais resíduos de aminoácidos do terminal N, terminal C, ou ambos. Este conjunto de peptídeos foi utilizado para identificar as sequências de aminoácidos cruciais para a ligação MRGPRX2.

A experiência com linhas de células de mastro humanos (LAD-2) mostrou que essas células são difíceis de cultivar e manter in vitro: um tempo de duplicação de duas semanas, suplementos médios caros e atenção direta necessária durante a passagem³. Esses atributos tornam as células inadequadas para a triagem em larga escala de ligantes potenciais. Aqui, células HEK transfectadas com estalagem expressando receptor MRGPRX2 (HEK-X2) foram usadas para tela da biblioteca de peptídeos¹. As células HEK-293 são amplamente utilizadas e estudadas para a expressão heteróloga dos receptores superficiais devido à sua alta eficiência de transfecção, taxa de duplicação mais rápida e a necessidade de suplementos médios não caros para serem cultivados em laboratório⁴. O protocolo para transfetar a linha celular HEK-293 foi demonstrado e está bem estabelecido⁵. As células HEK-293 expressando o receptor MRGPRX2 (passagem 13-19) foram ativadas com os peptídeos gerados através de N-truncation, C-truncation, N+C-truncation e alanina scaning¹. As células HEK do tipo selvagem (HEK-WT) (passagem 16-21) foram utilizadas como controle. A liberação intracelular de cálcio após a ativação foi monitorada para estudar a ativação baseada em MRGPRX2.

A ativação celular pelo MRGPRX2 é seguida por uma mobilização citosolítica de cálcio. Esta liberação de cálcio intracelular regulada em células de mastro é regulada pela entrada de cálcio operada na loja (SOCE), coordenada pela molécula de interação estromal 1 (STIM1); e é central para a cascata de resposta imune^6,7. Vários métodos têm sido utilizados para detectar concentração intracelular de cálcio, incluindo grampos de remendo e corantes fluorescentes⁸. De todas as técnicas disponíveis, corantes fluorométricos de cálcio em conjugação com várias técnicas de detecção estão sendo amplamente utilizados⁹. Dois tipos de corantes fluorométricos que ganharam interesses são: corantes de comprimento de onda único como Fluo-4, e corantes complexos de comprimento de onda duplos como Indo -1 e Fura-2. A vantagem que os corantes de comprimento de onda duplo trazem sobre corantes de comprimento de onda único é que os corantes ratiométricos corretos para erros experimentais como carregamento de corante, branqueamento de fotos e foco^10,11.

Fura-2 acetoximethyl ester (Fura-2 AM) é uma célula permeada, corante verde-fluorescente cuja excitação muda para um comprimento de onda mais baixo sobre a ligação de cálcio. Experimentalmente, a Fura-2 está animada em 340 e 380 nm, enquanto a emissão é registrada em 510 nm. Após a ligação de cálcio, a intensidade fluorescente a 340 nm aumenta enquanto a de 380 nm diminui, como mostra a Figura 1. Os dados são representados como uma razão de intensidade de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a intensidade após excitação em 380 nm (F380) ou seja, F340/F380. A razão F340/F380 é proporcional ao cálcio intracelular, o valor pode ser calculado pela equação de Grynkiewicz¹². Uma vez que o sinal de fluorescência é obtido a partir da excitação do corante em dois comprimentos de onda (340 nm e 380 nm), a razão dos sinais de fluorescência corrige para fatores experimentais como carregamento de corante, vazamento de corante, fotobleaching e densidades celulares.