Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos se activan principalmente por la unión de un antígeno al complejo receptor de inmunoglobulina E (IgE) – FcεRI, o por el recientemente descubierto receptor de proteína G relacionado con mas-X2 (MRGPRX2)¹. La activación de MRGPRX2 se ha relacionado con varias enfermedades inmunes e inflamatorias, y por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión del receptor a sus ligandos². Para hacerlo, se desarrolló una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas y se cribó contra los receptores MRGPRX2 que estaban sobreexpresados en las células HEK. En el estudio, la biblioteca de péptidos se construyó utilizando las técnicas simples y versátiles de escaneo de alanina y truncamiento de aminoácidos. La exploración con alanina implica reemplazar aminoácidos específicos con un residuo de alanina. La alanina es pequeña y neutra, despoja al péptido de las propiedades específicas conferidas por el residuo reemplazado y resalta consecutivamente la importancia de las respectivas propiedades fisicoquímicas del aminoácido en las interacciones receptoras. Por el contrario, en el truncamiento de aminoácidos, las secuencias peptídicas están diseñadas de tal manera que carecen de uno o más residuos de aminoácidos del terminal N, terminal C o ambos. Este conjunto de péptidos se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos cruciales para la unión a MRGPRX2.

La experiencia con líneas de mastocitos humanos (LAD-2) ha demostrado que estas células son difíciles de cultivar y mantener in vitro:un tiempo de duplicación de dos semanas, costosos suplementos medios y atención directa requerida durante el paso³. Estos atributos hacen que las células no sean adecuadas para el cribado a gran escala de ligandos potenciales. Aquí, se utilizaron células HEK transfectadas de manera estable que expresan el receptor MRGPRX2 (HEK-X2) para examinar la biblioteca de péptidos¹. Las células HEK-293 son ampliamente utilizadas y estudiadas para la expresión heteróloga de receptores de superficie debido a su alta eficiencia de transfección, tasa de duplicación más rápida y la necesidad de que se culticen suplementos medios no costosos en laboratorio⁴. El protocolo para transfectar la línea celular HEK-293 ha sido demostrado y está bien establecido⁵. Las células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor MRGPRX2 (paso 13-19) se activaron con los péptidos generados a través del N-truncamiento, C-truncamiento, N+C-truncamiento y escaneo de alanina¹. Se utilizaron células HEK de tipo salvaje (HEK-WT) (paso 16-21) como control. La liberación intracelular de calcio tras la activación fue monitoreada para estudiar la activación basada en MRGPRX2.

La activación celular por MRGPRX2 es seguida por una movilización de calcio citosólico. Esta liberación de calcio intracelular regulada en los mastocitos está regulada por la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), coordinada por la molécula de interacción estromal 1 (STIM1); y es central en la cascada de respuesta inmune^6,7. Se han utilizado varios métodos para detectar la concentración de calcio intracelular, incluyendo pinzas de parche y colorantes fluorescentes⁸. De todas las técnicas disponibles, los colorantes fluorométricos de calcio en conjugación con diversas técnicas de detección están siendo ampliamente utilizados⁹. Dos tipos de colorantes fluorométricos que han ganado interés son, a saber, los tintes de longitud de onda única como Fluo-4, y los tintes de relación de longitud de onda dual como Indo-1 y Fura-2. La ventaja que aportan los tintes ratiométricos de doble longitud de onda sobre los tintes de longitud de onda única es que los tintes ratiométricos corrigen errores experimentales como la carga del tinte, el fotoblanqueo y el enfoque^10,11.

El éster acetoximetílico fura-2 (Fura-2 AM) es un colorante verde-fluorescente penetrante en las células cuya excitación cambia a una longitud de onda más baja al unirse al calcio. Experimentalmente, Fura-2 se excita a 340 y 380 nm, mientras que la emisión se registra a 510 nm. Tras la unión al calcio, la intensidad fluorescente a 340 nm aumenta mientras que la de 380 nm disminuye, como se muestra en la Figura 1. Los datos se representan como una relación entre la intensidad de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la intensidad después de la excitación a 380 nm (F380), es decir, F340 / F380. La relación F340/F380 es proporcional al calcio intracelular, cuyo valor se puede calcular mediante la ecuación de Grynkiewicz¹². Dado que la señal de fluorescencia se obtiene de la excitación del tinte en dos longitudes de onda (340 nm y 380 nm), la relación de las señales de fluorescencia corrige factores experimentales como la carga del tinte, la fuga de tinte, el fotoblanqueo y las densidades celulares.