Screening von Peptiden, die MRGPRX2 mit engineered HEK Cells aktivieren
Summary
Techniken zur Erzeugung einer Bibliothek von kurzen Peptiden, die Mastzellen über den MRGPRX2-Rezeptor aktivieren können, werden beschrieben. Zugehörige Techniken sind einfach, kostengünstig und können auf andere Zellrezeptoren ausgeweitet werden.
Abstract
Die Identifizierung von Liganden, die für therapeutisch signifikante Zellrezeptoren spezifisch sind, ist für viele Anwendungen von entscheidender Bedeutung, einschließlich des Designs und der Entwicklung neuer Therapeutika. Mas-verwandter G-Protein-Rezeptor-X2 (MRGPRX2) ist ein wichtiger Rezeptor, der die Mastzellaktivierung reguliert und somit die allgemeine Immunantwort lenkt. Zahlreiche Liganden für MRGPRX2 wurden identifiziert und umfassen endogene Peptide wie PAMPs, Defensine, LL-37 und andere Proteinfragmente (d.h. abgebautes Albumin). Die weitere Identifizierung von MRGPRX2-spezifischen Liganden erfordert das Screening einer großen Anzahl von Peptiden (d. H. Peptidbibliothek); Mastzellen sind jedoch schwierig und teuer in vitro zu pflegen und daher nicht wirtschaftlich für das Screening einer großen Anzahl von Molekülen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit demonstriert eine Methode zum Entwerfen, Entwickeln und Screenen einer Bibliothek kleiner Peptidmoleküle unter Verwendung von MRGPRX2-exprimierenden HEK-Zellen. Diese Zelllinie ist relativ einfach und kostengünstig zu warten und kann für in vitro Hochdurchsatzanalysen verwendet werden. Ein calciumempfindlicher Fura-2-Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung des intrazellulären Kalziumflusses bei Aktivierung wurde verwendet, um die Aktivierung zu überwachen. Zur Berechnung der Calciumkonzentration wurde das Verhältnis der Fluoreszenzintensität von Fura-2 bei 510 nm zu Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm verwendet. Die Peptidbibliothek, die zur Verifizierung dieses Systems verwendet wurde, basierte auf dem endogenen Proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) Sekretagog, von dem bekannt ist, dass es MRGPRX2 mit hoher Spezifität und Affinität bindet. Nachfolgende Peptide wurden durch Aminosäurekürzung und Alanin-Scanning-Techniken erzeugt, die auf PAMP-12 angewendet wurden. Die hier beschriebene Methode ist einfach und kostengünstig und dennoch robust für das Screening einer großen Bibliothek von Verbindungen, um Bindungsdomänen und andere wichtige Parameter zu identifizieren, die eine wichtige Rolle bei der Rezeptoraktivierung spielen.
Introduction
Mastzellen sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems und spielen eine entscheidende Rolle sowohl bei angeborenen als auch bei adaptiven Immunantworten. Mastzellen werden in erster Linie entweder durch die Bindung eines Antigens an den Immunglobulin E (IgE) – FcεRI-Rezeptorkomplex oder durch den kürzlich entdeckten mas-verwandten G-Proteinrezeptor-X2 (MRGPRX2)1aktiviert. Die MRGPRX2-Aktivierung wurde mit mehreren Immun- und Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht, und daher ist es wichtig, den Bindungsmechanismus des Rezeptors an seine Liganden zu verstehen2. Dazu wurde eine Bibliothek kleiner Peptidmoleküle entwickelt und gegen MRGPRX2-Rezeptoren gescreent, die in HEK-Zellen überexprimiert wurden. In der Studie wurde die Peptidbibliothek mit den einfachen und vielseitigen Techniken des Alanin-Scannings und der Aminosäurekürzung konstruiert. Beim Alanin-Scanning werden bestimmte Aminosäuren durch einen Alaninrest ersetzt. Da Alanin klein und neutral ist, entfernt es dem Peptid die spezifischen Eigenschaften, die der ersetzte Rückstand verleiht, und unterstreicht nacheinander die Bedeutung der jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aminosäure in Rezeptorinteraktionen. Im Gegenteil, bei der Aminosäurekürzung sind Peptidsequenzen so konzipiert, dass ein oder mehrere Aminosäurereste aus dem N-Terminal, C-Terminal oder beiden fehlen. Dieser Satz von Peptiden wurde verwendet, um die Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die MRGPRX2-Bindung entscheidend sind.
Die Erfahrung mit menschlichen Mastzellenlinien (LAD-2) hat gezeigt, dass diese Zellen schwer zu kulturieren und in vitrozu pflegen sind: eine Verdopplungszeit von zwei Wochen, teure mittlere Ergänzungen und direkte Aufmerksamkeit während des Passierenserforderlich 3. Diese Eigenschaften machen die Zellen ungeeignet für ein großflächiges Screening potenzieller Liganden. Hierin wurden stabil transfizierte HEK-Zellen, die den MRGPRX2-Rezeptor (HEK-X2) exprimieren, verwendet, um die Peptidbibliothek1zu screenen. HEK-293-Zellen sind weit verbreitet und werden für die heterologe Expression von Oberflächenrezeptoren aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz, schnelleren Verdopplungsrate und der Notwendigkeit, untentbstliche mittlere Ergänzungen im Labor kultiviert zuwerden, untersucht 4. Das Protokoll zur Transfektiose der HEK-293-Zelllinie wurde nachgewiesen und ist gut etabliert5. HEK-293-Zellen, die stabil den MRGPRX2-Rezeptor exprimieren (Passage 13-19), wurden mit den Peptiden aktiviert, die durch N-Kürzung, C-Trunkierung, N + C-Kürzung und Alanin-Scanning erzeugt wurden1. Wildtyp-HEK-Zellen (HEK-WT) (Passage 16-21) wurden als Kontrolle verwendet. Die intrazelluläre Kalziumfreisetzung bei Aktivierung wurde überwacht, um die MRGPRX2-basierte Aktivierung zu untersuchen.
Auf die Zellaktivierung durch MRGPRX2 folgt eine zytosolische Calciummobilisierung. Diese regulierte intrazelluläre Kalziumfreisetzung in Mastzellen wird durch den speicherbetriebenen Kalziumeintrag (SOCE) reguliert, der durch das stromale Wechselwirkungsmolekül 1 (STIM1) koordiniert wird; und ist zentral für die Immunantwortkaskade6,7. Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration nachzuweisen, einschließlich Patch-Clamps und fluoreszierende Farbstoffe8. Von allen verfügbaren Techniken werden fluorometrische Calciumfarbstoffe in Konjugation mit verschiedenen Nachweistechniken weit verbreitet verwendet9. Zwei Arten von fluorometrischen Farbstoffen, die Interesse gewonnen haben, sind nämlich Einzelwellenlängenfarbstoffe wie Fluo-4 und duale wellenlängenverhältnismetrische Farbstoffe wie Indo-1 und Fura-2. Der Vorteil, den ratiometrische Farbstoffe mit zwei Wellenlängen gegenüber Farbstoffen mit einer Wellenlänge bringen, besteht darin, dass die ratiometrischen Farbstoffe experimentelle Fehler wie Farbstoffbeladung, Fotobleichen und Fokussierenkorrigieren 10,11.
Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2 AM) ist ein zelldurchlässiger, grün fluoreszierender Farbstoff, dessen Anregung sich bei der Calciumbindung auf eine niedrigere Wellenlänge verschiebt. Experimentell wird Fura-2 bei 340 und 380 nm angeregt, während die Emission bei 510 nm aufgezeichnet wird. Bei der Calciumbindung nimmt die Fluoreszenzintensität bei 340 nm zu, während die von 380 nm abnimmt, wie in Abbildung 1gezeigt. Die Daten werden als Verhältnis der Fluoreszenzintensität nach Anregung bei 340 nm (F340) zu der Intensität nach Anregung bei 380 nm (F380) dargestellt, d. h. F340/F380. Das F340/F380-Verhältnis ist proportional zu intrazellulärem Kalzium, dessen Wert durch die Grynkiewicz-Gleichung12berechnet werden kann. Da das Fluoreszenzsignal aus der Anregung des Farbstoffs bei zwei Wellenlängen (340 nm und 380 nm) gewonnen wird, korrigiert das Verhältnis der Fluoreszenzsignale experimentelle Faktoren wie Farbstoffbelastung, Farbstoffleckage, Photobleaching und Zelldichten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kalziumsignalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Degranulation von Mastzellen und wurde häufig bei der Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Interaktionen, der Ligandenidentifikation und der Wirkstoffforschungeingesetzt 14. MRGPRX2 ist ein kürzlich entdeckter Mastzellrezeptor, der eine Schlüsselrolle bei vielen entzündlichen Erkrankungen wie Juckreiz, Asthma und atopischer Dermatitis spielt, unter anderem2. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere zugelass…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR und LDU möchten Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC und NSERC-Discovery Grant für dieses Projekt anerkennen.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
Referenzen
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