Menneskelige nyre tubuloid kulturer representerer en verdifull in vitro modell for å studere nyre fysiologi og sykdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevev (sunt og sykt) samt urin, sistnevnte representerer en lett oppnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.
Voksen stamcelle (ASC)-avledet humane nyre epitelial organoider, eller tubuloider, kan etableres fra sunn og syk nyre epitel med høy effektivitet. Normale nyre tubuloider recapitulate mange aspekter av deres opprinnelsesvev. De representerer distinkte nephron segmenter – spesielt av proksimal tubule, løkke av Henle, distal tubules, og samle kanal – og kan brukes til å studere normal nyrefysiologi. Videre legger tubuloidteknologi til rette for sykdomsmodellering, for eksempelfor smittsomme sykdommer så vel som for kreft. Å skaffe nyre epitelceller for tubuloid generasjon er imidlertid avhengig av rester kirurgisk materiale (for eksempel delvis) nephrectomies) eller nålebiopsier. Evnen til å vokse tubuloider fra urin ville gi en alternativ, mindre invasiv kilde til sunne nyreepitelceller. Det har tidligere vist seg at tubuloidkulturer kan genereres fra bare noen få milliliter fersk samlet urin. Denne artikkelen beskriver protokollene for å generere og forplante ASC-avledede menneskelige nyre tubuloidkulturer fra vevs- og urinprøver.
Nyrer utfører funksjonen til systemisk styring av balansen mellom kroppsvæsker. Svekkelsen av deres fysiologiske funksjon kan skyldes forskjellige faktorer, inkludert diabetes, hypertensjon og legemiddelindusert toksisitet1. For en bedre forståelse av normal nyrefysiologi samt utvikling av nyresykdommer, er bruk av representative prekliniske modeller avgjørende. I de senere år har flere in vitro nyremodeller blitt generert basert på den såkalte organoidteknologien2. Organoider er tredimensjonale, multicellulære strukturer som ligner morfologien og fysiologien til vevet (normalt eller sykt) som de stammer fra. De kan genereres fra pluripotente (PSCer) eller voksne stamceller (ASC), hver med sine egne egenskaper og applikasjoner.
PSC-avledede nyreorganoider etterligner nefrogenese3,4,5. De kan også etableres fra pasientavledede engasjerte celler ved tvungen dedifferensiering (indusert pluripotens eller iPSC). iPSCer kan deretter differensieres i de forskjellige celletypene av nefroen, nyrenes funksjonelle enhet, ved rettidig eksponering for spesifikke vekstfaktorcocktailer. Mens de lager et ganske komplett miniorgan i en tallerken, forblir deres etablering tidkrevende, og på grunn av omprogrammeringsprotokollen kan iPSCer være utsatt for uønsket genetisk ustabilitet6. Videre er iPSC organoider ikke i stand til å modnes fullt ut til voksne nyreceller, og avslører en transkripsjonsprofil som ligner foster nyre på et tidlig utviklingsstadium7.
ASC-avledede humane nyre tubuloider har vist seg å rekapitulere fornyelsen av voksen nyre epitel. De representerer først og fremst den proksimale tubule, løkken av Henle, distale tubuli og samle kanal, som bekreftet av uttrykket av forskjellige transportørproteiner8,9,10. Tubuloidkulturprotokollen muliggjør rask utvidelse av pasientavledet nyrevev, samtidig som det beholder et stabilt genom. Forskningsapplikasjoner inkluderer å studere normal nyrefysiologi, nefrotoksisitet, legemiddeltesting, samt sykdomsmodellering8,10,11,12. En potensiell begrensning av etableringen av pasientavledede organoidkulturer, inkludert tubuoider, er tilgjengeligheten av ferskt vev. Imidlertid har flere rapporter vist at urin kan tjene som kilde for nyreepitelceller, og dermed gi en mye enklere, mindre invasiv strategi for å skaffe pasientmateriale til tubuloidkulturer8,13,14. Faktisk har det nylig blitt vist at tubuloider kan dyrkes fra urin8. Denne artikkelen beskriver etablering og vedlikehold av tubuloidkulturer fra nyrevev og urin.
Organoider betraktes som avatarer av vevet de er avledet fra. De tillater rask utvidelse av pasientmaterialet samtidig som de beholder de genotypiske og fenotypiske egenskapene til opprinnelsesvevet15. Organoid teknologi har nylig åpnet dørene for utvikling av mer representative prekliniske modeller, som kan brukes som viktige verktøy for å oversette funn fra benken til sengen. Nyre tubuloider er lovende in vitro modeller for testing av legemiddelindusert nefrotoksisitet, en vanlig bivirkning av mange kjemoterapeutiske legemidler2,8,12. Som sådan ble pasientavledede tumororganoidkulturer vist å være prediktive for pasientrespons på behandling16,17,18. Testing av legemidler på en høy gjennomstrømningsmåte på tubuloider tillater derfor potensielt bedre definisjon av terapeutiske vinduer og reduserer risikoen for legemiddelindusert nefrotoksisitet hos pasienter.
Ofte brukte antibiotika har blitt beskrevet for å utøve en toksisk effekt på nyrene19. Selv om tilstedeværelsen av bredspektret antibiotika er nødvendig for vellykket etablering av kulturene ved å forhindre forurensning, er det viktig å vurdere deres potensielle nefrotoksisitet. Selv om det ikke er observert negative effekter av antibiotika ved etablering av tubuloidkulturer, er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å evaluere effektene grundig. Tubuloider kan utnyttes for å studere og modellere sykdommer8. Ciliopatier (patologisk dysfunksjon av cilia) samt andre genetiske syndromer som påvirker nyrene, kan studeres ved enten å generere tubuloide linjer direkte fra berørte personer, eller ved å bruke sunne kulturer der sykdomsspesifikke drivermutasjoner kan introduseres via CRISPR / Cas9 genomredigering20.
Selv om tubuloider er multicellulære nyrekulturer, mangler de flere nyrecelletyper, inkludert podocytter og endotelceller8. I motsetning til noen andre ASC-avledede organoidmodeller har tubuloider et begrenset replikeringspotensial, da de kan dyrkes i ca. 15 passasjer. Denne begrensede levetiden kan imidlertid utvides betydelig ved å legge Wnt til kulturmediet21. Ytterligere optimalisering av tubuloidkulturprotokollen er nødvendig for å gjøre dem enda mer representative for nyrene, inkludert mer differensierte celletyper. Selv om effektiviteten av tubuloid etablering fra vevsprøver er svært høy (>95%), kan det i sjeldne tilfeller mislykkes. Det kan være forskjellige årsaker, inkludert: 1) dårlig kvalitet på startmaterialet(f.eks.nekrotisk vev som følge av medikamentell behandling), 2) over fordøyelsesbesvær av vevsprøven, eller 3) forurensning av primærprøven.
For å sikre at kvaliteten på vevsprøvene som mottas er tilstrekkelig til å fortsette med protokollen, er det viktig å opprettholde nær kontakt med patologipersonalet som utfører evalueringen av vevet ved kirurgi. Hvis tilstrekkelig materiale er tilgjengelig, må levedyktigheten bekreftes ved histologisk undersøkelse(f.eks.hematoksylin og eosinfarging). Videre, for å forhindre cellelys under enzymatisk fordøyelse, er det viktig at inkubasjonsprosedyren ikke er lenger enn 1 t. Til slutt, for å forhindre forurensning, bør antibiotika og antifungale midler legges til vaske- og kulturmediene.
Urin kan inneholde eksfolierte epitelceller som ikke er avledet fra nyre22, som kan forurense tubuloidkulturene. Disse inkluderer for eksempel urotheliumceller som i motsetning til nyrerørformede celler, positive for tumorprotein P63 og negativ for PAX88. Det anbefales derfor å teste kulturene for PAX8 positivitet for å bekrefte renheten av etablerte nyre tubuloid linjer før du fortsetter med oppfølging eksperimenter (Figur 4B).
Urin representerer et fiendtlig miljø for celler på grunn av høyt osmotisk trykk og lav pH. Det er derfor avgjørende for suksessen til protokollen at prøver behandles så snart som mulig ved urinoppsamling. Som sådan skal den oppsamlede urinen fortynnes og vaskes grundig med bufret løsning så snart som mulig for å sikre tilstedeværelse av levedyktige celler på tidspunktet for såing. Suksessraten for tubuloid etablering vil reduseres betydelig hvis urinen lagres i flere timer før behandling. Til slutt, selv om den er steril, har urin en høy risiko for forurensning forbundet med innsamlingsprosessen. Det er derfor viktig å supplere vask og vekstmedium med antibiotika og antifungale midler. Når du tar hensyn til alt ovenfor, kan en suksessrate på ca. 50% oppnås.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle pasientene og deres familier for at de deltok i studien. Vi takker det kliniske teamet som la til rette for forskningen vår. Vi er takknemlige for støtten fra European Research Council (ERC) som starter stipend 850571 (J.D.), Dutch Cancer Society (KWF)/Alpe d’HuZes Bas Mulder Award (nr. 10218, J.D.), Oncode Institute og Foundation Children Cancer Free (KiKa nr. 292, C.C.)
A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
Primocin – broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |