Protocolo de preparación y transferencia de muestras para cristalografía de longitud de onda larga en vacío en Beamline I23 en Diamond Light Source

La difracción de rayos X de longitud de onda larga se utiliza para aprovechar las propiedades de dispersión anómalas de átomos de luz específicos presentes de forma nativa en macromoléculas. Esto ayuda a resolver el problema de la fase cristalográfica y a confirmar inequívocamente la identidad y la ubicación de dichos elementos dentro de las macromoléculas. Mientras que en los primeros días de la cristalografía macromolecular, las estructuras de novo se resolvían mediante el reemplazo isomorfo ^múltiple1, con el advenimiento de líneas de haz de rayos X sintonizables en sincrotrones, la fase experimental basada en técnicas de difracción anómala de longitud de onda múltiple y longitud de onda única (SAD) se ha convertido en el método ^dominante2 . Ambos métodos se han basado históricamente en la señal isomorfa o anómala de metales pesados, que deben introducirse artificialmente en los cristales mediante cocristalización o remojo de ^cristales3. El enfoque de prueba y error y el resultado impredecible pueden hacer que estos experimentos consuman frustrantemente tiempo. La incorporación de seleno-metionina durante la expresión de ^proteínas4 es una forma muy elegante de superar estas limitaciones y explotar la difracción anómala en longitudes de onda cortas, aunque puede ser muy desafiante en los sistemas de expresión de proteínas eucariotas.

Mx de longitud de onda larga es extremadamente atractivo para la determinación de la estructura mediante experimentos nativos de ^SAD5,6 debido a la conveniencia de usar cristales directamente de un ensayo de cristalización exitoso sin tratamiento adicional. Adicionalmente, el acceso a los bordes de absorción de elementos de alta importancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo, abre la oportunidad de identificar directamente las posiciones de estos elementos en macromoléculas7,8,9,10. A resolución media y baja, la asignación de elementos basada en la densidad de electrones 2Fo-Fc y el entorno químico puede ser difícil, particularmente para elementos con un número similar de electrones o iones débilmente unidos con ocupaciones parciales. Estas ambigüedades pueden resolverse mediante la recopilación de datos por debajo y por encima del borde de absorción del elemento de interés y la interpretación de los mapas de Fourier de diferencia anómala en fase de modelo ^{resultante11,12}. La localización de las posiciones de los átomos de azufre en estos mapas también puede ayudar a la construcción de modelos en mapas de densidad de electrones de baja ^{resolución13}. Los bordes de absorción de estos elementos ligeros se observan en longitudes de onda entre λ = 3 y 6 Å (ver Figura 1, arriba). Este rango de longitud de onda ha estado mucho más allá de las capacidades de cualquier línea de haz MX de sincrotrón, y una operación eficiente en este rango requiere superar varios desafíos técnicos, como se describe a continuación.

Beamline I23 en Diamond Light Source, Reino Unido, es un instrumento único, diseñado específicamente para facilitar experimentos MX de longitud de onda larga, sintonizable en un rango de longitud de onda entre λ = 1.13 y 5.9 Å (rango de energía entre E = 2.1 y 11 keV). Al operar en un entorno de alto ^vacío14, se elimina la absorción y dispersión del aire, lo que mejora la eficiencia de los experimentos de difracción y la relación señal-ruido. Una gran estación final de vacío encierra todos los componentes del entorno de la muestra, incluido el detector semicilíndrico Pilatus 12M, un goniómetro multieje, los sistemas de visualización y colimación en línea, así como el equipo a medida para la transferencia y el almacenamiento de muestras (Figura 2). Cada equipo se ha optimizado para garantizar que se puedan recopilar los datos de longitud de onda larga de mejor calidad. El detector curvo Pilatus 12M puede recopilar ángulos de difracción de 2θ = ±100°, lo que resulta en datos de difracción de resolución suficientemente altos incluso en longitudes de onda más largas (Figura 1, abajo). Los 120 módulos detectores han sido seleccionados específicamente para la compatibilidad de baja energía y se han proporcionado calibraciones para un modo adicional de ganancia ultra alta.

El umbral de detector más bajo posible es de 1,8 keV, lo que lleva a un aumento de los efectos de esquina y borde para energías inferiores a 3,6 keV y se puede observar una calidad de datos comprometida en las longitudes de onda más largas, particularmente para cristales de baja mosaicidad. Este efecto en combinación con la disminución de la eficiencia cuántica del ^detector15 debe tenerse en cuenta al planificar un experimento. El goniómetro multieje permite la reorientación de los cristales para permitir estrategias de recopilación de datos que maximizan la calidad y la fuerza de la señal anómala, así como la integridad de los datos anómalos recopilados. La absorción de muestras es un factor limitante para los experimentos, particularmente en longitudes de onda más largas. Las correcciones de absorción, tal como se implementan en los paquetes de software de procesamiento MX de uso ^común16,17, están funcionando bien a longitudes de onda de alrededor de 3 Å. Las longitudes de onda más largas requerirán correcciones analíticas de absorción basadas en reconstrucciones ^{tomográficas18} o ablación con láser para eliminar material no difracante y cortar los cristales en formas bien ^definidas19. Este último también ayudará a reducir el tamaño de cristales más grandes, ya que los experimentos de difracción de rayos X en longitudes de onda más largas son más eficientes para cristales más ^pequeños14. El desafío de mantener las muestras a temperaturas criogénicas durante la recopilación de datos se aborda mediante el enfriamiento conductivo, ya que el uso de dispositivos de flujo abierto de flujo frío de gas no es compatible con un entorno de vacío. Por lo tanto, se necesitan materiales térmicamente conductores, como el cobre, para conectar la muestra a un refrigerador criogénico de tubo de pulso. Los pines estándar SPINE de acero inoxidable utilizados en todo MX, así como cualquier otro soporte de muestra disponible comercialmente, no son adecuados para MX de longitud de onda larga en vacío debido a su mala conductividad térmica.

Los soportes de muestra (SH) para MX en vacío deben ser una parte esencial de la vía térmica de eliminación de calor (Figura 3A). Como tales, consisten en un cuerpo y un pasador de cobre térmicamente conductores e incluyen dos características importantes: una base de imán fuerte para garantizar un enlace térmico adecuado a la cabeza del goniómetro frío, y un soporte de muestra, hecho de poliimida, para minimizar la absorción y dispersión de rayos ^X20. Se hicieron esfuerzos para garantizar que la experiencia del usuario de la recolección de cristales y el enfriamiento por flash sea casi idéntica a la asociada con las prácticas estándar de MX. Como los SH I23 dedicados no son directamente compatibles con otras líneas de haz de sincrotrón, se utiliza un adaptador de acero inoxidable para la compatibilidad con las varitas magnéticas de recolección de cristal y las interfaces de goniómetro existentes en otras líneas de haz MX (Figura 3B). El adaptador también es importante para hacer uso de las instalaciones de automatización en otras líneas de haz Diamond MX, que se basan en cabezales de pinza robot tipo ^ALS21 y diseños de base de estilo ^unipuck22, si la variación de la muestra requiere una preselección rápida para la selección de los mejores cristales de difracción. El protocolo de preparación y carga de muestras se puede dividir en dos etapas:

Etapa 1: Recolección de cristales y congelación instantánea realizada por los usuarios en sus propios laboratorios

Tras la evaluación de la idoneidad del proyecto para la recopilación de datos I23, los soportes de muestra con bucles que coinciden con los tamaños de cristal (preensamblados con adaptadores) se envían a los laboratorios de los usuarios para la recolección de cristales. Para evitar cualquier daño, los SH y los adaptadores no deben separarse y deben usarse como una unidad con el fin de pescar cristales con bucles de tamaño adecuado utilizando varitas magnéticas estándar de recolección de cristales. Como es común en MX, esta tarea se realiza manualmente bajo el microscopio, y los cristales se enfrían inmediatamente en un dewar de espuma con nitrógeno ^líquido23. Debido a un desajuste de fuerzas magnéticas, los SH actualmente no son compatibles con unipucks. El almacenamiento y el envío se realizan utilizando combipucks (consulte la Tabla de materiales), que están disponibles para los usuarios que lo soliciten, junto con los insertos de remitente seco compatibles (Figura 3C). Estos discos comparten la misma placa base con los unipucks ampliamente utilizados y permiten una rápida preselección de muestras en otras líneas de haz Diamond MX. Prestar este equipo a los usuarios es actualmente la mejor disposición, hasta que los portamuestras a medida estén disponibles comercialmente. El transporte a la línea de viga requiere los cargadores secos estándar utilizados en la comunidad MX.

Etapa 2: Transferencia de muestras crioenfriadas a la estación final de vacío

Una vez que las muestras llegan a la línea de haz, se preparan para su transferencia a la estación final de vacío. Esto implica la eliminación de los SH de los peinados y la separación de los adaptadores. La introducción de muestras biológicas al vacío se realiza rutinariamente en el campo de la criomicroscopía electrónica. Algunos de los conceptos bien establecidos se adaptaron para la transferencia de muestras I23. En resumen, los SH se transfieren bajo nitrógeno líquido a bloques de transferencia (Figura 3D). Estos bloques tienen una excelente conductividad térmica y una masa térmica significativa, evitando que los cristales alcancen la temperatura de transición vítrea cuando están en vacío. Hasta cuatro bloques, con una capacidad de cuatro muestras cada uno, se cargan bajo nitrógeno líquido en un disco de bloque (Figura 3H), que se utiliza para transferir muestras al Sistema de Transferencia Criogénica (CTS) o para el almacenamiento en dewars de nitrógeno líquido entre experimentos.

El Sistema de Transferencia Criogénica desarrollado en Diamond Light Source consta de dos subconjuntos, la Estación de Muestra y el Transbordador (Figura 4A). La Estación de Muestra consiste en un baño de nitrógeno líquido para el almacenamiento temporal de cristales de proteínas y tiene características específicas para garantizar la seguridad y permitir una experiencia fácil de usar (Figura 5). El CTS está controlado por un controlador lógico programable a través de una interfaz de pantalla táctil fácil de usar. La estación de muestreo tiene diodos emisores de luz incorporados para una mejor visualización y un conjunto de calentadores controlados en bucle cerrado para automatizar el secado del baño de nitrógeno líquido una vez que las muestras han sido transferidas. También tiene una variedad de sensores para garantizar la seguridad y el funcionamiento eficiente del sistema. La estación de muestra tiene hardware a medida para proporcionar una interfaz eléctrica confiable para interactuar con el transbordador para las operaciones, como el bombeo al vacío aproximado para la transferencia de muestras, así como el monitoreo de los niveles de nitrógeno líquido y la temperatura dentro del transbordador.

El Shuttle (Figura 6) es un dispositivo portátil utilizado para recoger un bloque de transferencia del baño de nitrógeno líquido de la Estación de Muestras y transferirlo dentro de un entorno criogénico y de vacío a la estación final. Incluye un dewar de nitrógeno líquido para mantener las muestras frías durante la transferencia, monitoreo del nivel de líquido en el dewar y una variedad de sensores para la operación y la seguridad del usuario. El brazo de transferencia está equipado con un accionamiento magnético e incluye ranuras mecanizadas para guiar a los usuarios en la carga y descarga segura de bloques de transferencia en la estación final. La transferencia desde el transbordador al recipiente de vacío se realiza a través de una esclusa de aire. La esclusa de aire es una interfaz para el transbordador en la estación final utilizada para evacuar el interespacio entre el transbordador y la estación final, antes de abrir las válvulas de vacío del transbordador y la estación final. Las secuencias de bombeo y ventilación están totalmente automatizadas y se pueden operar a través de una gran pantalla táctil con una interfaz fácil de usar (Figura 4C). El protocolo actual se utiliza para transferir un cristal de taumatina a la estación final de vacío para la recopilación de datos.