ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

長波長X線回折は、巨大分子に天然に存在する特定の光原子の異常な散乱特性を利用するために使用される。これは、結晶学的相の問題を解決し、巨大分子内のそのような元素の同一性および位置を明確に確認するのに役立つ。高分子結晶学の黎明期には、 de novo 構造は複数の同形置換によって解決されました^が1、シンクロトロンでの同調可能なX線ビームラインの出現により、多波長および単一波長(SAD)異常回折技術に基づく実験的フェージングが支配的な方法になりました².どちらの方法も歴史的に重金属からの同形または異常なシグナルに依存しており、共結晶化または結晶浸漬によって人工的に結晶に導入する必要があります³。試行錯誤のアプローチと予測不可能な結果は、これらの実験をイライラさせるほど時間がかかる可能性があります。タンパク質発現中のセレノメチオニンの取り込み^4は、 これらの制限を克服し、短波長での異常な回折を利用するための非常にエレガントな方法ですが、真核生物のタンパク質発現系では非常に困難な場合があります。

長波長MXは、さらなる治療を行わずに成功した結晶化試験から直接結晶を使用する利便性のために、ネイティブSAD実験^5,6による構造決定に非常に魅力的です。さらに、カルシウム、カリウム、塩素、硫黄、リンなどの生物学的に重要な元素の吸収端にアクセスすると、巨大分子中のこれらの元素の位置を直接特定する機会が開かれます7,8,9,10。中分解能および低分解能では、_2Fo-Fc電子密度および化学環境に基づく元素割り当ては、特に電子数が同程度または部分的に占有する弱く結合したイオンを有する元素では困難であり得る。これらの曖昧さは、関心のある要素の吸収端の下方および上方のデータを収集し、結果として生じるモデル位相異常差フーリエマップ^11、12の解釈によって解決することができる。これらのマップで硫黄原子の位置を特定することは、低分解能電子密度マップへのモデル構築にも役立ちます¹³。これらの軽元素の吸収端は、λ = 3 ~ 6 Å の間の波長で観察されます (図 1、上を参照)。この波長範囲は、シンクロトロンMXビームラインの能力をはるかに超えており、この範囲での効率的な運用には、以下に概説するように、いくつかの技術的課題を克服する必要があります。

英国のダイヤモンド光源にあるビームラインI23は、λ = 1.13〜5.9Å(E = 2.1〜11keVのエネルギー範囲)の波長範囲で調整可能な、長波長MX実験を容易にするために特別に設計されたユニークな装置です。高真空環境^{で動作することにより14}、空気の吸収と散乱が排除され、その結果、回折実験の効率と信号対雑音比が向上します。大きな真空エンドステーションには、半円筒形のPilatus 12M検出器、多軸ゴニオメーター、オンライン表示およびコリメーションシステム、サンプルの移送と保管のための特注機器など、サンプル環境のすべてのコンポーネントが含まれています(図2)。各機器は、最高品質の長波長データを収集できるように最適化されています。湾曲したPilatus 12M検出器は、回折角2θ = ±100°まで収集できるため、最長波長でも十分に高分解能の回折データが得られます(図1、下段)。120個の検出器モジュールは、低エネルギー互換性のために特別に選択され、追加の超高利得モードのための較正が提供されています。

検出器のスレッショルドは1.8keVと最も低く、3.6keV未満のエネルギーではコーナーとエッジの影響が大きくなり、最長波長、特にモザイ度の低い結晶ではデータ品質の低下が観測されます。この効果は、検出器量子効率¹⁵の低下と相まって、実験を計画する際に考慮する必要がある。多軸ゴニオメーターは、結晶の向きを変えることを可能にし、異常な信号の品質と強度、および収集された異常なデータの完全性を最大化するデータ収集戦略を可能にします。サンプル吸収は、特に最長波長での実験の制限要因です。吸収補正は、一般的に使用されるMX処理ソフトウェアパッケージ^16,17で実装されているように、3Å前後の波長に対してうまく機能しています。より長い波長では、断層再構成¹⁸またはレーザーアブレーションに基づく分析吸収補正が必要となり、非回折性物質を除去し、結晶をはっきりとした形状に切断します¹⁹。後者は、より長い波長でのX線回折実験がより小さな結晶に対してより効率的であるため、より大きな結晶のサイズを小さくするのにも役立ちます¹⁴。データ収集中にサンプルを極低温に保つという課題は、オープンフローの低温ガス流デバイスを使用することは真空環境と互換性がないため、導電性冷却によって対処されます。したがって、サンプルをパルス管クライオクーラーに接続するには、銅などの熱伝導性材料が必要です。MX全体で使用されるステンレス鋼のSPINE標準ピン、およびその他の市販のサンプルマウントは、熱伝導率が低いため、真空中長波長MXには適していません。

真空中MXのサンプルホルダ(SH)は、除熱熱経路の重要な部分でなければなりません(図3A)。このように、それらは熱伝導性の銅体とピンで構成され、2つの重要な特徴を含みます:冷たいゴニオメータヘッドへの適切な熱リンクを確保するための強力な磁石ベースと、X線吸収と散乱を最小限に抑えるためのポリイミド製のサンプルマウント²⁰。クリスタルハーベスティングとフラッシュ冷却のユーザーエクスペリエンスが、標準的なMXプラクティスに関連するものとほぼ同じであることを保証するための努力が払われました。専用のI23 SHは他のシンクロトロンビームラインと直接互換性がないため、他のMXビームライン上の結晶収穫磁気ワンドおよび既存のゴニオメータインターフェースとの互換性のためにステンレス鋼アダプタが使用されます(図3B)。このアダプターは、ALSタイプのロボットグリッパーヘッド21とunipuckスタイルのベースレイアウト22に基づく他のDiamond ^MXビームラインの自動化機能を利用するためにも重要です。サンプル調製およびローディングプロトコルは、次の 2 つの段階に分けることができます。

ステージ1:結晶の収穫と、ユーザーが自分の研究室で行うフラッシュフリーズ

I23データ収集に対するプロジェクトの適合性の評価後、水晶サイズに一致するループ(アダプターで事前に組み立てられた)を備えたサンプルホルダーは、結晶収穫のためにユーザーラボに送られます。損傷を防ぐために、SHとアダプターは分離してはならず、標準的な水晶採取磁気杖を使用して適切なサイズのループで水晶を釣る目的で1つのユニットとして使用する必要があります。MXでよくあるように、この作業は顕微鏡下で手動で行われ、結晶は液体窒素²³による泡のデュワーで直ちにフラッシュ冷却される。磁力の不一致のため、SHは現在ユニパックと互換性がありません。保管と出荷は、コンビパック( 材料表を参照)を使用して実現され、要求に応じてユーザーが利用できるとともに、互換性のあるドライシッパーインサート(図3C)を使用します。これらのパックは、広く使用されているユニパックと同じベースプレートを共有し、他のDiamond MXビームラインでのサンプルの迅速な事前スクリーニングを可能にします。この機器をユーザーに貸与することは、オーダーメイドのサンプルホルダーが市販されるまで、現在最良の取り決めです。ビームラインへの輸送には、MXコミュニティで使用される標準的なドライシッパーが必要です。

ステージ2:真空端電場への凍結冷却サンプルの移送

サンプルがビームラインに到着すると、真空エンドステーションへの移送の準備が整います。これには、コンビパックからのSHの除去とアダプターからの分離が含まれます。真空への生体試料の導入は、クライオ電子顕微鏡の分野で日常的に行われている。十分に確立された概念のいくつかは、I23サンプル転送に適合しました。要するに、SHは液体窒素下で移送ブロック上に転写されます(図3D)。これらのブロックは、優れた熱伝導率と顕著な熱質量を有し、真空中に結晶がガラス転移温度に達するのを防ぎます。最大4つのブロック(それぞれ4つのサンプルの容量を持つ)は、液体窒素の下でブロックパックにロードされ(図3H)、サンプルを極低温移送システム(CTS)に移送するか、実験間の液体窒素デュワーに保管するために使用されます。

ダイヤモンド光源で開発された極低温搬送システムは、サンプルステーションとシャトルの2つのサブアセンブリで構成されています(図4A)。サンプルステーションは、タンパク質結晶を一時的に保管するための液体窒素浴で構成され、安全性を確保し、ユーザーフレンドリーな体験を可能にする特定の機能を備えています(図5)。CTSは、ユーザーフレンドリーなタッチスクリーンインターフェースを介してプログラム可能なロジックコントローラによって制御されます。サンプルステーションには、より優れた視覚化のために発光ダイオードが組み込まれており、サンプルが移送された後の液体窒素浴の乾燥を自動化するためにクローズループで制御される一連のヒーターがあります。また、システムの安全性と効率的な機能を保証するためのさまざまなセンサーも備えています。サンプルステーションは、サンプル移送のための粗い真空へのポンピング、液体窒素レベルとシャトル内の温度の監視など、操作のためにシャトルと対話するための信頼性の高い電気インターフェースを提供するオーダーメイドのハードウェアを備えています。

シャトル(図6)は、サンプルステーションの液体窒素浴から移送ブロックを拾い上げ、極低温および真空環境内でエンドステーションに移送するために使用されるポータブルデバイスです。これには、移送中にサンプルを低温に保つための液体窒素デュワー、デュワー内の液体レベル監視、および操作とユーザーの安全のためのさまざまなセンサーが含まれています。トランスファーアームには磁気ドライブが装備されており、機械加工された溝が含まれており、ユーザーがトランスファーブロックをエンドステーションに安全にロードおよびアンロードできるようにガイドします。シャトルから真空容器への移動は、エアロックを介して行われる。エアロックは、シャトルとエンドステーションの真空バルブを開く前に、シャトルとエンドステーションの間のインタースペースを排気するために使用されるエンドステーション上のシャトルのインターフェースです。ポンピングシーケンスとベントシーケンスは完全に自動化されており、ユーザーフレンドリーなインターフェースを備えた大型タッチスクリーンを介して操作できます(図4C)。現在のプロトコルは、データ収集のためにソーマチン結晶を真空エンドステーションに転送するために使用されます。