Protocollo di preparazione e trasferimento dei campioni per cristallografia a lunghezza d'onda lunga sotto vuoto su Beamline I23 presso Diamond Light Source

La diffrazione a raggi X a lunga lunghezza d’onda viene utilizzata per sfruttare le proprietà di diffusione anomala di specifici atomi di luce presenti nativamente nelle macromolecole. Questo aiuta a risolvere il problema della fase cristallografica e a confermare in modo inequivocabile l’identità e la posizione di tali elementi all’interno delle macromolecole. Mentre nei primi giorni della cristallografia macromolecolare, le strutture de novo sono state risolte mediante sostituzione isomorfa ^multipla1, con l’avvento di linee di fascio di raggi X sintonizzabili ai sincrotroni, la fasatura sperimentale basata su tecniche di diffrazione anomala multi-lunghezza d’onda e singola lunghezza d’onda (SAD) sono diventati i metodi ^dominanti2 . Entrambi i metodi si sono storicamente basati sul segnale isomorfo o anomalo dei metalli pesanti, che devono essere introdotti artificialmente nei cristalli mediante co-cristallizzazione o immersione dei ^cristalli3. L’approccio per tentativi ed errori e l’esito imprevedibile possono rendere questi esperimenti frustranti e dispendiosi in termini di tempo. L’incorporazione della seleno-metionina durante l’espressione ^proteica4 è un modo molto elegante per superare queste limitazioni e sfruttare la diffrazione anomala a lunghezze d’onda corte, sebbene possa essere molto impegnativa nei sistemi di espressione proteica eucariotica.

MX a lunghezza d’onda lunga è estremamente interessante per la determinazione della struttura da esperimenti SAD ^nativi5,6 a causa della comodità di utilizzare cristalli direttamente da uno studio di cristallizzazione di successo senza ulteriori trattamenti. Inoltre, l’accesso ai bordi di assorbimento di elementi di elevata importanza biologica, come calcio, potassio, cloro, zolfo e fosforo, apre l’opportunità di identificare direttamente le posizioni di questi elementi nelle macromolecole7,8,9,10. A media e bassa risoluzione, l’assegnazione degli elementi in base alla densità elettronica 2Fo-Fc e all’ambiente chimico può essere difficile, in particolare per elementi con un numero simile di elettroni o ioni debolmente legati con occupazioni parziali. Queste ambiguità possono essere risolte raccogliendo dati sotto e sopra il bordo di assorbimento dell’elemento di interesse e l’interpretazione della risultante differenza anomala modellata sulle mappe di ^Fourier11,12. Localizzare le posizioni degli atomi di zolfo in queste mappe può anche aiutare la costruzione di modelli in mappe di densità elettronica a bassa ^{risoluzione13}. I bordi di assorbimento di questi elementi leggeri sono osservati a lunghezze d’onda comprese tra λ = 3 e 6 Å (vedi Figura 1, in alto). Questa gamma di lunghezze d’onda è stata ben oltre le capacità di qualsiasi beamline MX di sincrotrone e un funzionamento efficiente in questo intervallo richiede il superamento di diverse sfide tecniche, come descritto di seguito.

Beamline I23 a Diamond Light Source, Regno Unito, è uno strumento unico, specificamente progettato per facilitare esperimenti MX a lunga lunghezza d’onda, sintonizzabile in un intervallo di lunghezze d’onda compreso tra λ = 1,13 e 5,9 Å (intervallo di energia tra E = 2,1 e 11 keV). Operando in un ambiente ad alto ^vuoto14, l’assorbimento d’aria e la dispersione vengono eliminati, migliorando di conseguenza l’efficienza degli esperimenti di diffrazione e il rapporto segnale-rumore. Una grande stazione terminale per vuoto racchiude tutti i componenti dell’ambiente campione, tra cui il rilevatore semicilindrico Pilatus 12M, un goniometro multiasse, i sistemi di visualizzazione e collimazione in linea, nonché le apparecchiature su misura per il trasferimento e lo stoccaggio dei campioni (Figura 2). Ogni apparecchiatura è stata ottimizzata per garantire che possano essere raccolti i dati di lunghezza d’onda lunga della migliore qualità. Il rivelatore curvo Pilatus 12M può raccogliere angoli di diffrazione di 2θ = ±100°, ottenendo dati di diffrazione sufficientemente ad alta risoluzione anche alle lunghezze d’onda più lunghe (Figura 1, in basso). I 120 moduli rivelatori sono stati specificamente selezionati per la compatibilità a basso consumo energetico e sono state fornite calibrazioni per un’ulteriore modalità di guadagno ultra-alto.

La soglia del rivelatore più bassa possibile è di 1,8 keV, portando a maggiori effetti angolari e di bordo per energie inferiori a 3,6 keV e si può osservare una qualità dei dati compromessa alle lunghezze d’onda più lunghe, in particolare per i cristalli a bassa mosaicità. Questo effetto in combinazione con la diminuzione dell’efficienza quantistica del ^rivelatore15 deve essere preso in considerazione quando si pianifica un esperimento. Il goniometro multiasse consente il riorientamento dei cristalli per consentire strategie di raccolta dati che massimizzano la qualità e la forza del segnale anomalo, nonché la completezza dei dati anomali raccolti. L’assorbimento del campione è un fattore limitante per gli esperimenti, in particolare alle lunghezze d’onda più lunghe. Le correzioni di assorbimento, implementate nei pacchetti software di elaborazione MX comunemente ^usati16,17, funzionano bene a lunghezze d’onda intorno a 3 Å. Lunghezze d’onda più lunghe richiederanno correzioni analitiche di assorbimento basate su ricostruzioni ^{tomografiche18} o ablazione laser per rimuovere materiale non diffrattante e tagliare i cristalli in forme ben ^definite19. Quest’ultimo aiuterà anche a ridurre le dimensioni dei cristalli più grandi poiché gli esperimenti di diffrazione a raggi X a lunghezze d’onda più lunghe sono più efficienti per i cristalli più ^piccoli14. La sfida di mantenere i campioni a temperature criogeniche durante la raccolta dei dati viene affrontata dal raffreddamento conduttivo, poiché l’utilizzo di dispositivi a flusso di gas freddo a flusso aperto non è compatibile con un ambiente sottovuoto. Quindi, i materiali termicamente conduttivi, come il rame, sono necessari per collegare il campione a un criorefrigeratore a tubo a impulsi. I perni standard SPINE in acciaio inossidabile utilizzati in MX, così come qualsiasi altro supporto per campioni disponibile in commercio, non sono adatti per MX a lunghezza d’onda lunga nel vuoto a causa della loro scarsa conduttività termica.

I portacampioni (SHs) per MX sotto vuoto devono essere una parte essenziale della via termica di rimozione del calore (Figura 3A). In quanto tali, sono costituiti da un corpo e un perno in rame termicamente conduttivi e includono due caratteristiche importanti: una solida base magnetica per garantire un adeguato collegamento termico alla testa del goniometro freddo e un supporto per campioni, realizzato in poliimmide, per ridurre al minimo l’assorbimento e la dispersione dei raggi ^X20. Sono stati compiuti sforzi per garantire che l’esperienza utente di raccolta dei cristalli e raffreddamento flash sia quasi identica a quella associata alle pratiche MX standard. Poiché gli SH I23 dedicati non sono direttamente compatibili con altre linee di fascio di sincrotrone, viene utilizzato un adattatore in acciaio inossidabile per la compatibilità con le bacchette magnetiche per la raccolta dei cristalli e le interfacce goniometriche esistenti su altre linee di fascio MX (Figura 3B). L’adattatore è importante anche per l’utilizzo delle strutture di automazione su altre beamline Diamond MX, che si basano su teste di pinza robot di tipo ^ALS21 e layout di base in stile ^unipuck22, se la variazione del campione richiede un rapido pre-screening per la selezione dei migliori cristalli diffrattanti. Il protocollo di preparazione e caricamento del campione può essere suddiviso in due fasi:

Fase 1: Raccolta dei cristalli e congelamento flash eseguita dagli utenti nei propri laboratori

Dopo la valutazione dell’idoneità del progetto per la raccolta dei dati I23, i portacampioni con anelli corrispondenti alle dimensioni dei cristalli (pre-assemblati con adattatori) vengono inviati ai laboratori degli utenti per la raccolta dei cristalli. Per evitare danni, gli SH e gli adattatori non devono essere separati e devono essere utilizzati come un’unica unità allo scopo di pescare cristalli con anelli di dimensioni appropriate utilizzando bacchette magnetiche standard per la raccolta dei cristalli. Come è comune in MX, questa attività viene eseguita manualmente al microscopio e i cristalli vengono immediatamente raffreddati al flash in un dewar di schiuma con azoto ^liquido23. A causa di una mancata corrispondenza delle forze magnetiche, gli SH non sono attualmente compatibili con gli unipucks. Lo stoccaggio e la spedizione sono realizzati utilizzando pettine (vedi tabella dei materiali), che sono disponibili per gli utenti su richiesta, insieme agli inserti di spedizione a secco compatibili (Figura 3C). Questi puck condividono la stessa piastra di base con gli unipucks ampiamente utilizzati e consentono un rapido pre-screening dei campioni su altre beamline Diamond MX. Il prestito di questa apparecchiatura agli utenti è attualmente la soluzione migliore, fino a quando i possessori di campioni su misura non saranno disponibili in commercio. Il trasporto alla beamline richiede gli spedizionieri a secco standard utilizzati nella comunità MX.

Fase 2: Trasferimento di campioni criorefrizionati nella stazione terminale del vuoto

Una volta che i campioni arrivano sulla beamline, vengono preparati per il trasferimento nella stazione terminale del vuoto. Ciò comporta la rimozione di SHs dai pettinati e la separazione dagli adattatori. L’introduzione di campioni biologici nel vuoto viene eseguita abitualmente nel campo della microscopia crioelettronica. Alcuni dei concetti consolidati sono stati adattati per il trasferimento del campione I23. In breve, gli SH vengono trasferiti sotto azoto liquido su blocchi di trasferimento (Figura 3D). Questi blocchi hanno un’eccellente conduttività termica e una massa termica significativa, impedendo ai cristalli di raggiungere la temperatura di transizione vetrosa quando sono sotto vuoto. Fino a quattro blocchi, con una capacità di quattro campioni ciascuno, vengono caricati sotto azoto liquido in un disco di blocco (Figura 3H), che viene utilizzato sia per il trasferimento di campioni al sistema di trasferimento criogenico (CTS) o per lo stoccaggio in azoto liquido dewars tra gli esperimenti.

Il sistema di trasferimento criogenico sviluppato presso Diamond Light Source comprende due sottoinsiemi, la stazione campione e lo shuttle (Figura 4A). La Sample Station è costituita da un bagno di azoto liquido per la conservazione temporanea di cristalli proteici e ha caratteristiche specifiche per garantire la sicurezza e consentire un’esperienza user-friendly (Figura 5). Il CTS è controllato da un controller logico programmabile tramite un’interfaccia touchscreen intuitiva. La stazione di campionamento ha diodi emettitori di luce integrati per una migliore visualizzazione e una serie di riscaldatori controllati in circuito chiuso per automatizzare l’essiccazione del bagno di azoto liquido una volta che i campioni sono stati trasferiti. Ha anche una varietà di sensori per garantire la sicurezza e il funzionamento efficiente del sistema. La sample station dispone di hardware su misura per fornire un’interfaccia elettrica affidabile per interagire con la navetta per le operazioni, come il pompaggio fino al vuoto grezzo per il trasferimento del campione, nonché il monitoraggio dei livelli di azoto liquido e della temperatura all’interno della navetta.

Lo Shuttle (Figura 6) è un dispositivo portatile utilizzato per prelevare un blocco di trasferimento dal bagno di azoto liquido della Sample Station e trasferirlo all’interno di un ambiente criogenico e vuoto alla stazione finale. Include un dewar di azoto liquido per mantenere i campioni freddi durante il trasferimento, il monitoraggio del livello del liquido nel dewar e una varietà di sensori per il funzionamento e la sicurezza dell’utente. Il braccio di trasferimento è dotato di un azionamento magnetico e include scanalature lavorate per guidare gli utenti nel carico e nello scarico sicuri dei blocchi di trasferimento nella stazione finale. Il trasferimento dalla navetta al recipiente a vuoto viene effettuato tramite una camera d’aria. L’airlock è un’interfaccia per lo shuttle sulla stazione terminale utilizzata per evacuare l’intercapedine tra la navetta e la stazione terminale, prima di aprire le valvole del vuoto dello shuttle e della stazione finale. Le sequenze di pompaggio e sfiato sono completamente automatizzate e possono essere azionate tramite un ampio touchscreen con un’interfaccia user-friendly (Figura 4C). L’attuale protocollo viene utilizzato per trasferire un cristallo di taumatina alla stazione terminale del vuoto per la raccolta dei dati.