냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

1. 상류를 위한 사카로미세스 세레비시아 세포의 재배 및 준비 사카로미세스 세레비시아에대한 액체 성장 배지를 준비한다. 성장 매체의 준비를 위한 500mL 유리 병을 오토클레이브. 효모 추출물 2.2g(1.1%)과 펩톤(2.2%)의 4.4g의 무게를 측정하고 200mL의 물에 섞는다. 121°C에서 15분 동안 자동 으로 살균합니다. 포도당 분말 10 g의 무게와 20 % 포도당 용액을 얻기 위해 물 50 mL에 혼합. 0.2 μm 필터를 통과하여 4°C에 저장합니다. 사카로미세스 세레비시아에대한 견고한 매체를 준비한다. 한천 분말 4 g의 무게와 200 mL의 성장 매체와 혼합. 121°C에서 15분 동안 오토클레이브로 살균합니다. 배지를 40-50°C로 냉각시키고 20% 멸균 포도당의 20mL를 추가합니다(이전 단계에서 준비). 페트리 접시에 전체 매체의 ~20mL를 붓고 주변 온도에서 고화시키십시오. 파막에 한천 판을 감싸서 건조로부터 보호하고 4°C에 보관하십시오. 현탁액의 문화 사카로미세스 세레비시아참고: 프로토콜은 셀라인 Saccharomyces cerevisiae 균주 BY4741 [ATCC 4040002] 또는 이와 유사한 균주의 현탁액으로부터 극저온-FIBM에 대한 샘플의 제조에 최적화된다. 50mL 에를렌마이어(또는 이와 유사한) 플라스크를 오토클레이브. 후드 또는 라미나르 플로우 박스에서 작업합니다. 배피10mL의 성장 배지에서 멸균 50mL 에를렌마이어 플라스크. 여과된 20% 포도당 1mL로 배지를 보충하십시오. 멸균, 일회용 접종 루프 (1-10 μL)와 함께 한천 접시에서 효모의 한 식민지를 선택합니다. 기하급수적 위상에 도달할 때까지 인큐베이터 및 배양에 Erlenmeyer 플라스크를 30°C(150-200 rpm)로 놓습니다( 약 7h).참고: 4주 동안 주변 온도에서 배양된 한천 판에서 식민지를 수확할 때 ~15h 후에 기하급수적인 위상에 도달하는 것을 관찰했습니다. 아래 참고 사항도 참조하십시오. 글리세롤 재고의 한천 접시에 문화 사카로미세스 세레비시아에. 4°C 스토리지에서 새 한천 판을 사용하십시오. -80°C 깊은 냉동고에서 S. 세레비시아에 육수를 가지고 재고의 완전한 해동을 피하기 위해 동결 스탠드에 놓습니다. 멸균 접종 루프(1-10 μL)를 사용하여 작은 배양을 긁어 내고 성장 배지의 50 μL로 이송합니다. 제대로 섞으세요. 혼합 S. 세레바제 문화의 전체 부피를 전송하고 한마판의 표면에 멸균 확산 막대기로 분산. 직경 1.5-2mm 식민지가 형성될 때까지 약 48시간 동안 30°C에서 배양한다.참고: 실험 전에 식민지를 갓 배양하는 것이 좋습니다. 1주 이상 식민지는 기하급수적인 성장 단계에 도달하기 위해서는 액체 매체의 재배기간이 길어질 것이다. 한천 접시에 문화 사카로미세스 세레비시아에. 재배 된 S. 세레바시아 식민지와 준비 된 한천 접시를 사용합니다. 파이펫 10 mL의 멸균 성장 매체와 50 mL Erlenmeyer 플라스크에 20 % 포도당을 여과하였다. 멸균 접종 루프와 S. 세레비시아 문화의 한 식민지를 선택하고 플라스크에서 성장 매체와 혼합. 교반 (150-200 rpm)으로 30 °C에서 50 분 동안 배양하십시오. 성장 배지로 서스펜션 배양을 10회 희석하고 멸균 확산 막대기로 한천 판에 50 μL의 현탁액을 분산시다. 1.5-2mm 식민지까지 약 48시간 동안 30°C에서 배양한다. 페트리 접시의 가장자리를 파라필름으로 감싸서 건조를 방지합니다. 실온에 보관하고 최대 4주 동안 사용하십시오. 세포 클러스터에서 급락 동결에 대한 사카로미세스 cerevisiae을 준비합니다. S. 세레비시아세포 배양을 현탁액의 사카로미세스 세레비시아(Section 1.3)의 절배의 프로토콜에 따라 준비하고 교반(150-200rpm)으로 30°C에서 ~7h를 배양한다. UV/Vis 분광광계를 사용하여 600 nm에서 S. 세레비시아 세포 현탁액 배양의 OD를 측정합니다. 셀 현탁액을 OD600 = 1로 농축합니다. 세포 단층에서 동결 급락S. 세레비시아에 대한 준비. S. cerevisiae 세포 배양을 준비 S. saccharomyces cerevisiae 현탁액 세포 배양의 섹션 재배에 프로토콜에 따라 및 교반 (150-200 rpm)와 30 °C에서 ~7 h를 배양한다. UV/Vis 분광기계를 사용하여 600 nm에서 S. 세레비시아세포 현탁액 배양의 OD를 측정한다. 중간 매체의 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 상대 원심력(900 x g)에서 2분간 부드럽게 회전합니다. 파이펫팅하여 셀 펠릿에서 배지를 폐기합니다. 셀 펠릿에 신선한 배지를 추가합니다. 배지의 부피를 계산하여 30 에서 60까지 의 DC600의 셀 서스펜션을 얻습니다. 글리세롤(50% 스톡 용액)을 세포 현탁액에 추가하여 진동 직전에 5%의 최종 농도를 추가합니다.참고: 글리세롤은 보호제로 작동하여 세포 사이의 영역에서 얼음의 품질을 향상시킵니다. 글리세롤은 세포내 섭취를 최소화하기 위해 진동하기 직전에 세포에 첨가됩니다. 2. 사카로미세스 세레비시아에 표본의 진동 30-45s (압력: 6-9 Pa, 전류: 7 mA)를 향한 탄소 필름 측의 글로우 방전 TEM 그리드. 진동 로봇을 다음 매개 변수로 설정 : 온도 : 18 ° C, 습도 : 100 %, blot 시간 : 6 s, 대기 시간 : 5 s, 블로팅 사이클 : 1x 및 블롯 힘 : 5.참고: Blot 힘은 계측기별 값이며 최적의 블롯 힘 값은 다른 기계와 다를 수 있습니다. 특정 플런저에 대한 최적의 값을 실험적으로 확인해야 합니다. 유리화용 액체 에탄을 준비합니다. 비 흡수성 표면 패드를 샘플을 향한 블로팅 패드에 장착합니다. 필터 용지를 다른 블로팅 패드에 사용합니다. 핀셋으로 광선 배출 그리드를 선택하고 핀셋을 플런지 동결 기기에 장착합니다. 플런저 기후 챔버 내부그리드의 탄소 측에 S. 세레바시아에 현탁액의 3.5 μL을 적용한다. 그리드의 모든 응용 프로그램 전에 제대로 섞습니다. 플런지 플런지 액체 에탄에 그리드를 고정합니다. 액체 에탄에서 LN2로그리드를 전송합니다. LN2 조건 하에서 유리화된 셀로 그리드를 저장하거나 FiB-SEM 현미경으로 로딩하기 위해 TEM 그리드 카트리지에 장착합니다. 3. 그리드 카트리지에 TEM 그리드 장착 참고: 여기에 설명된 워크플로우는 그리드 카트리지에 장착된 TEM 그리드를 사용하여 SEM과 TEM 현미경 간의 샘플 처리 및 전송을 용이하게 합니다. 카트리지 어셈블리는 C 링, TEM 그리드 및 C-클립 링으로 구성됩니다. 다른 현미경 제조 업체에서 계측 작업 하는 경우 다른 옵션을 사용할 수 있습니다. 그리드 카트리지 어셈블리 워크스테이션은 LN2로채워져 있습니다. LN2 레벨은 TEM 그리드로 그리드 박스를 커버하지만 TEM 그리드를 카트리지에 장착하면 LN2 증기에서 수행됩니다. 시편에 호흡하는 오염을 방지하기 위해 진동 시술 중에 보호 페이스 마스크 또는 방패를 착용하는 것이 좋습니다. 얼음 오염을 축적 한 도구로 작동하지 마십시오. 그리드 카트리지 조립 워크스테이션을 함께 배치하고 클리핑을 위한 건식 도구를 준비합니다. LN2로어셈블리 워크스테이션을 식힙니다. 클리핑 도구를 LN2 온도로 냉각시하십시오. 유리화 된 샘플이있는 그리드 상자를 어셈블리 워크스테이션에 놓습니다. C 링으로 아래로 향하는 셀이 있는 표본이 있는 TEM 그리드를 놓고 C-클립으로 고정합니다. 잘린 카트리지를 그리드 박스에 넣고 제대로 닫습니다. LN2 Dewar에 카트리지를 저장하거나 FIB-SEM 현미경으로 로드합니다. 4. FIB-SEM 현미경에 샘플의 적재 및 조작 참고: 이 지침은 PP3010 극저온-FIB/SEM 준비 시스템을 갖춘 이중 빔 현미경 Versa 3D의 활용을 위해 작성되었습니다. 대체 솔루션에는 서로 다른 특정 매개 변수가 필요할 수 있습니다. 그러나 워크플로의 일반적인 개념은 여전히 유효해야 합니다. 현미경을 액체 질소 온도까지 식힙니다. 현미경 챔버 및 준비 챔버 (존재하는 경우)를 냉각 (< 4 x 10-4 Pa)의 시작 전에 높은 진공으로 펌핑하여 오염 성장을 방지합니다. 준비 챔버, 현미경 단계 및 현미경 오염물질에 대해 질소 가스 흐름을 5 L/min으로 설정합니다. 모든 구성 요소가 < -180 °C의 온도에 도달 할 때까지 기다립니다.참고: 이 연구에 사용된 FIB-SEM 현미경 설정은 냉각된 질소 가스를 사용하여 단계와 오염물질 방지기를 냉각시합니다. 다른 시스템은 스테이지 냉각을 위해 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 챔버 압력은 단계 및 오염물질이 여기에 사용되는 기기에 -190 °C에 일단 ~ 3 x 10-5 Pa에 도달합니다. 본 연구에서 사용되는 실험용 설정과 함께 라멜라 표면에 탄화수소 오염 층의 성장속도는 ~15nm/시간이다. 그리드 카트리지를 시편으로 현미경으로 로드합니다. 로딩 스테이션을 LN2 온도로 조립하고 식힙니다. 셔틀(샘플 홀더), 시편이 있는 그리드 박스, 그리드 박스 오프너 및 핀셋을 냉각 된 로딩 스테이션에 놓습니다. 조심스럽게 셔틀로 향하는 표본으로 그리드 카트리지를 전송합니다. 로딩 스테이션 내부의 셔틀을 로딩 위치로 뒤집습니다. 현미경에 적재합니다. 선택적으로, 금속 보호 층으로 표본을 코팅.참고: 냉동 수화 생물학적 물질 SEM을 이미징할 때 강력한 충전 효과를 관찰할 수 있습니다. 또한 FIB를 사용한 생물학적 샘플을 이미징(낮은 전류에서도)은 빠른 시료 손상을 유도합니다. 따라서 시료표면을 보호하기 위해 FIB-SEM 현미경 내부에서 시료의 추가 코팅이 수행될 수 있다. 가스 분사 시스템(GIS)에 의해 유기금속 백금으로 보호층을 증정한다. 샘플을 유중심 높이로 설정합니다(전자 및 이온을 가진 이미징을 위한 우연의 일치 점). 스테이지를 다시 45°로 기울입니다(전자 빔에 비해 90° 기울어진 샘플). z-축4mm에서 스테이지를 유중심 높이 아래 이동합니다. GIS 바늘을 26-30°C로 설정합니다. 생물학적 표본을 가진 그리드에 유기금속 백금 층의 300-1000 nm를 입금한다(GIS 증착의 30-120s에 해당).참고: 우리는 일반적으로 작은 세포 클러스터를 가진 견본을 위해 30 s및 세포의 단층이 있는 견본을 위한 45 s를 위한 GIS를 적용합니다. 스퍼터는 전도성 금속 층으로 시편 표면을 코팅합니다. 생물학적 표본을 가진 그리드에 금속 층(Ir, Au, Pt)의 ~10nm를 기탁한다. 라멜라 제제를 위한 현미경 파라미터 설정 FIB의 경우 고전압 = 30kV, 전류 = 10 pA(이미징), 10 pA-3 nA(FIB 밀링) SEM의 경우 고전압 = 2-5 kV, 스팟 크기 = 4.5, 현재 = 8-27 pA의 다음 매개 변수를 사용합니다. 두 빔에 대해 스캔 회전을 180°로 설정합니다. 단계 기울기 설정: 밀링 각도 6-11°(SEM과 FIB 컬럼 사이의 52°각도로 45°의 사전 기울기와 FIB/SEM 현미경으로 샘플 셔틀의 13°-18°의 스테이지 기울기에 해당). 5. 사카로미세스 세레비시아에 라멜라 의 준비 그리드 품질을 확인하고 Saccharomyces cerevisiae의적합한 클러스터를 선택합니다. TEM 그리드가 셀 클러스터 주변또는 그리드의 뒷면에 추가 물 없이 양쪽에서 제대로 블로워져 있는지 확인합니다.참고: 그리드의 뒷면을 확인하려면 스테이지를 -10°로 회전시키고 FIB로 그리드를 이미지합니다. 다음 권장 사항에 따라 라멜라 제제를 위한 최적의 셀 클러스터를 선택합니다. 셀 클러스터를 그리드 중심에 배치합니다. 밀링 영역은 그리드 중앙에 위치한 치수 1100 x 1100 μm(그리드 중심에서 각 방향에서 550μm)으로 사각형 외부로 확장해서는 안 됩니다. 그리드 막대에 겹치지 않고 그리드 사각형의 중앙 부분에 셀 클러스터를 배치합니다. 압축 격자 사각형에 셀 클러스터를 균열없이 컴팩트한 구멍이 뚫린 카본 호일로 배치합니다. 클러스터가 얼음 오염으로 둘러싸여 있지 않은지 확인합니다. 사카로미세스 세레비시아에 단층에서 최적의 밀링 위치를 선택합니다. 선택한 그리드 사각형의 셀 모노레이어를 둘러싼 그리드 막대가 표시되는지 확인합니다. 다음 권장 사항에 따라 셀룰러 단층에서 최적의 위치를 선택합니다. 밀링에 선택한 영역은 다음 기준을 충족해야 합니다. 그리드 중심에 관심 영역을 갖습니다. 밀링 영역은 그리드 중앙에 위치한 치수 1100 x 1100 μm의 사각형 외부로 확장되어서는 안 됩니다(그리드의 중심에서 각 방향으로 550 μm). 그리드 막대와 겹치지 않고 그리드 사각형의 중앙 부분에 관심 영역을 갖습니다. 세포 단층층을 얼음 오염으로 둘러싸고 있지 마십시오. 극저온-FIB로 S. 세레비시아에 라멜라를 준비한다.참고: 밀링 패턴은 관심 영역을 기준으로 생성되고 중심이 됩니다. Cryo-FIBM은 다양한 FIB 설정에서 수행되는 여러 밀링 단계로 순차적으로 수행됩니다. 약 2 μm 두께의 라멜라는 처음에 높은 전류(0.3-3 nA)를 사용하여 분쇄됩니다. 그런 다음 라멜라가 점차 500nm로 얇아질 수 있습니다. 낮은 전류(10-30 pA)에서 미세 밀링 단계는 라멜라를 ~100-200 nm 두께로 마무리하는 데 사용됩니다. 관심 영역(ROI)을 유중심 높이로 설정하고 이 위치를 저장합니다.참고: 모든 위치에 대해 일치 지점을 결정하고 저장해야 합니다. 동심 높이는 스테이지를 0°로 기울이고 x 및 y 방향으로 스테이지를 이동하여 ROI를 중심으로 설정됩니다. 그런 다음 스테이지가 25°로 기울어져 ROI가 스테이지 z-축위치를 변경하여 스캔 영역의 중심으로 다시 가져온다. 마지막으로, 스테이지는 밀링을 위해 13°-18°로 다시 기울어져 있습니다. 위에서 아래로 스캔 방향을 사용하여 ROI 위의 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다. 아래쪽에서 위쪽으로 의 스캔 방향을 사용하여 ROI 아래에 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다. 라멜라 두께의 대략적인 추정을 위해 관심 영역을 덮는 비활성 직사각형 밀링 패턴을 정의합니다. 이 패턴은 라멜라 제조 중에 분쇄되지 않습니다. 모든 패턴을 표시하고 라멜라너비(x 치수)를 설정합니다. 밀링 패턴의 너비가 클러스터 너비의 2/3을 초과해서는 안 됩니다. 이는 대부분의 경우 8-15 μm에 해당합니다. 거친 밀링 단계에 대한 매개 변수 설정 FIB 전류: 0.3-3.0 nA; 최종 라멜라 두께: 1.5-2 μm; FIBM 영역의 너비: 8-12 음; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하. FIB 전류: 0.3-1.0 nA; 최종 라멜라 두께: 1 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하. FIB 전류: 100-300 pA; 최종 라멜라 두께: 0.5 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하. FIB 전류: 30-100 pA; 최종 라멜라 두께: 0.3 μm; FIBM 영역의 폭: 7.5-11.5 μm; 스테이지 틸트: 13-17°; 소요시간: 8분; 활성 밀링 패턴: 상하. 미세 밀링 단계에 대한 매개 변수 설정: FIB 전류: 10-30 pA; 최종 라멜라 두께: <0.2 um; FIBM 영역의 폭 : 7-11 μm; 스테이지 틸트: 13-17° (+1°); 소요시간: 12분; 활성 밀링 패턴: 상부.참고: 거친 밀링 단계(5.3.6)는 각 라멜라에 대해 순차적으로 수행됩니다. 대조적으로, 미세 밀링 단계(5.3.7)는 거친 밀링을 직접 따르지 않지만, 라멜라 표면의 탄화수소 오염을 최소화하기 위해 세션 말기의 모든 라멜라에 대해 미세 밀링 단계가 순차적으로 수행된다. 미세 밀링 단계에서 +1° 스테이지 틸트가 추가로 사용되어 길이 전반에 걸쳐 라멜라 두께의 균일성을 높입니다. 6. 사카로미세스 세레비시아에 라멜라를 저온-TEM으로 이전 제대로 말린 드와르를 준비하고 LN2로채웁니다. 극저온 조건에서 FIB/SEM 현미경으로 라멜라로 샘플을 내리고, 그리드 박스로 전송하고, 장기 저장을 위해 LN2 스토리지 Dewar에 저장합니다. 또는 그리드를 저저온-TEM에 직접 로드합니다. cryo-TEM 단계 기울기 축에 상대적인 라멜라의 올바른 방향이 중요합니다(자세한 내용은 8:10에 함께 제공되는 비디오 참조). 준비된 라멜라의 밀링 방향이 저온-TEM 스테이지 틸트 축에 수직이 되도록 합니다. 극저온-TEM 스테이지를 미리 기울여 그리드 평면에 비해 라멜라 기울기를 보정하고 용량 대칭방식(19)을사용하여 틸트 계열을 수집한다.참고: 프리 틸트의 크기(일반적으로 6-8°)는 마이크로머시징 중 TEM 그리드 평면과 FIB 방향 사이의 각도에 의해 결정됩니다. 저온-TEM의 이미지에서 라멜라 전면 가장자리의 위치를 사용하여 미리 기울어진 각도의 표시를 결정할 수 있습니다. 이를 위해 현미경 단계 회전의 감각을 알려야 한다. 실험용 설정에서 나노프로브 SA 모드에서 촬영한 이미지의 오른쪽에 있는 라멜라의 전면 가장자리의 위치는 음의 프리 틸트에 해당합니다.