JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62351
, , ,
1Central European Institute of Technology,Masaryk University

Summary

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Tegenwoordig is cryo-elektronentomografie (cryo-ET) de enige techniek die structurele gegevens met een bijna atomaire resolutie kan leveren over macromoleculaire complexen in situ. Vanwege de sterke interactie van een elektron met de materie zijn cryo-ET-studies met hoge resolutie beperkt tot monsters met een dikte van minder dan 200 nm, wat de toepasbaarheid van cryo-ET alleen beperkt tot de perifere gebieden van een cel. Een complexe workflow die bestaat uit de voorbereiding van dunne cellulaire doorsneden door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining (cryo-FIBM) werd in het afgelopen decennium geïntroduceerd om de verwerving van cryo-ET-gegevens uit het binnenste van grotere cellen mogelijk te maken. We presenteren een protocol voor de bereiding van cellulaire lamellen uit een monster verglaasd door plunge freezing met behulp van Saccharomyces cerevisiae als een prototypisch voorbeeld van een eukaryote cel met breed gebruik in cellulair en moleculair biologisch onderzoek. We beschrijven protocollen voor vitrificatie van S. cerevisiae in geïsoleerde vlekken van enkele cellen of een continue monolaag van de cellen op een TEM-rooster en bieden een protocol voor lamellenpreparaat door cryo-FIB voor deze twee monsters.

Introduction

Recente technologische en softwareontwikkelingen hebben elektronen cryo-microscopie (cryo-EM) van verglaasde biologische monsters tot een van de belangrijkste technieken in het structurele biologieonderzoek in het afgelopen decenniumgemaakt 1,2. De voorbereiding van een monster voor cryo-EM bestaat meestal uit het aanbrengen van een gezuiverd eiwit of een eiwitcomplex met nucleïnezuur op de monsterdrager (TEM-raster), gevolgd door verwijdering van het grootste deel van de vloeistof met een filterpapier en het bevriezen van het rooster met de resterende dunne laag van een monster in vloeibaar ethaan of propaan3 . Het monster wordt dus gefixeerd in een dunne laag (meestal <80 nm) amorfe buffer in een volledig gehydrateerde toestand, onder bijna-inheemse omstandigheden en zonder enige chemische fixatie of contrastering van zware metalen. Beeldvorming van het structureel homogene monster in de transmissie-elektronenmicroscoop resulteert vervolgens in gegevens die kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de driedimensionale structuur van het macromolecuul met bijna atomaire resolutie met behulp van een enkel deeltjesanalyseprotocol2. Een dergelijke in vitro structuur komt overeen met de representatie van het macromolecuul onder de omstandigheden en behandeling die worden gebruikt tijdens de monstervoorbereiding. Hoewel de structuren die onder de in vitro omstandigheden worden bepaald, meestal overeenkomen met de volledig functionele toestand van het macromolecuul, zou het vermogen om ruimtelijke relaties tussen verschillende macromoleculen in de cel in beeld te brengen een extra functionele context bieden aan de structurele gegevens.

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) wordt gebruikt om 3D-volumes van pleomorfe objecten of macromoleculaire complexen in situ4,5te reconstrueren. Het voordeel van cryo-ET is dat de driedimensionale informatie wordt verkregen door een enkele entiteit in beeld te brengen. De resolutie waarbij individuele macromoleculaire complexen of organellen worden waargenomen is echter zeer beperkt. Daarom is het gemiddelde van de macromoleculen (subtomogramgemiddelde, STA) met dezelfde structuur van een groter aantal tomogrammen noodzakelijk om 4-8 Å-resolutiemodellen uit de cryo-ET-gegevens6,7te bereiken . Onlangs is aangetoond dat cryo-ET en STA ook kunnen worden toegepast om hoge-resolutiestructuren van macromoleculaire machines zoals ribosomen te bepalen in de context van de cellulaire omgeving7. Het gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie wordt echter beperkt door de dikte van het monster. Over het algemeen is dit geen probleem voor cryo-EM met één deeltje, waar optimalisatie van de verglazingsomstandigheden uiteindelijk kan resulteren in de inbedding van het monster in een dunne laag ijs. Aan de andere kant zijn de meeste cellen in feite niet elektronentransparant voor de elektronenbundel van 300 keV. Het inelastische gemiddelde vrije pad in de verglaasde biologische monsters voor de 300 keV-elektronen is ongeveer 395 nm8, wat betekent dat cryo-ET-studies voor de meeste cellen beperkt zijn tot de cellulaire periferie.

Er werden verschillende technieken ontwikkeld om het monster te verdunnen tot een voldoende dikte voor cryo-ET. Cryo-ultramicrotomie maakt gebruik van mechanische snijwerk van het monster met een diamantmes bij de vloeibare stikstoftemperatuur (-196 ° C) om 60-80 nm dikke secties te bieden die geschikt zijn voor cryo-ET9,10,11. Meerdere secties kunnen vanuit een enkele cel worden voorbereid en de data-analyse kan uiteindelijk 3D-structurele informatie produceren voor het grootste deel van de cel. De mechanische slicing kan echter verschillende artefacten veroorzaken, zoals gebogen secties, spleten of monstercompressie, die de resulterende structuur kunnen beïnvloeden en de cryo-ET-gegevens10,11,12kunnen vertekenen. Cryo-gerichte ionenbundelmicromachining (cryo-FIBM) vertegenwoordigt een alternatieve benadering waarbij een dunne cellulaire sectie wordt bereid door geleidelijke ablatie van het monster met behulp van een gerichte bundel Ga + -ionen (FIB) in een proces met meerdere stappen, wat kan resulteren in 80-300 nm dikke cellulaire doorsnede (lamellen)13,14,15 . In tegenstelling tot cryo-ultramicrotomie wordt slechts één lamellen bereid uit een enkele cel, die ~ 0,3-3% van het volume vertegenwoordigt, en micromachining van meerdere cellen is meestal nodig om een gebied van belang te vinden in de gefreesde doorsnede. Bovendien is de doorvoer van de hele workflow tegenwoordig nog vrij laag, vaak beperkt tot 6-8 hoogwaardige lamellen uit een cryo-FIBM-sessie van 8 uur. Aan de andere kant zijn de cryo-FIBM-doorsneden verstoken van compressieartefacten en bieden ze geschikte input voor cryo-ET met hoge resolutie. Bovendien is de overdracht van de lamellen naar de monsterdrager voor cryo-ET niet nodig, omdat het monster tijdens het hele lamellenpreparaatproces op het TEM-rooster wordt vastgehouden en hetzelfde rooster vervolgens naar TEM kan worden overgebracht. We verwachten dat de doorvoer van de cryo-FIBM binnenkort aanzienlijk zal worden verbeterd, voornamelijk door de beschikbaarheid van software voor het zonder toezicht frezen vanlamellen 16,17 en het gebruik van FIB’s die werken volgens het principe van ladingspaarplasma, wat een snellere materiaalablatie mogelijk maakt.

Saccharomyces cerevisiae (gist) zijn eukaryote cellen met een bolvorm en diameter van ~ 2-5 μm. Dankzij zijn grootte, toegankelijkheid, genetica, generatietijd en eenvoudige manipulatie wordt de gist uitgebreid bestudeerd als een eukaryote modelorganisme in cellulair en moleculair biologisch onderzoek vergelijkbaar met Escherichia coli, dat goed wordt bestudeerd als een prokaryotisch modelorganisme in de bacteriologie. De gist kan gemakkelijk in suspensie worden gekweekt en in korte tijd wordt een grote hoeveelheid cellen gegenereerd (verdubbelingstijd 1 – 2 uur). Wat nog belangrijker is, gist deelt een complexe interne cellulaire structuur met dierlijke en plantaardige cellen met behoud van een klein genoom dat bestaat uit een laag gehalte aan niet-coderend DNA. Structurele karakterisering van het gistproteoom uit de hoge resolutie in situ gegevens kan dus helpen om een mechanistische beschrijving te geven van de uitgebreide hoeveelheid functionele gegevens die beschikbaar zijn in de literatuur.

Hierin bieden we een uitgebreid protocol voor de verwerving van in situ cryo-ET-gegevens over het gistmonster, dat alle stappen omvat, van de monsterkweek tot het cryo-FIBM-lamellenpreparaat en de monsteroverdracht naar TEM voor cryo-ET-gegevensverzameling.

Protocol

1. Teelt en bereiding van Saccharomyces cerevisiae cellen voor vitrificatie Bereid vloeibaar groeimedium voor Saccharomyces cerevisiae. Autoclaaf een glazen fles van 500 ml voor de bereiding van groeimedium. Weeg 2,2 g gistextract (1,1%) en 4,4 g pepton (2,2%) af en meng 200 ml water. Steriliseer door autoclaveren gedurende 15 minuten bij 121 °C. Weeg 10 g glucosepoeder en meng 50 ml water om 20% glucose-oplossing te krijgen. Laat de oplossing door een filter van 0,2 μm lopen en bewaar deze bij 4 °C. Bereid vast medium voor Saccharomyces cerevisiae. Weeg 4 g agarpoeder en meng met 200 ml groeimedium. Steriliseer in een autoclaaf gedurende 15 min bij 121 °C. Koel het medium af tot 40-50 °C en voeg 20 ml 20% steriele glucose toe (bereid in de vorige stap). Giet ~20 ml van het volledige medium in de petrischaal en laat het stollen bij omgevingstemperatuur. Wikkel de agarplaten in parafilm ter bescherming tegen droging en bewaar bij 4 °C. Cultuur Saccharomyces cerevisiae in suspensieOPMERKING: Het protocol is geoptimaliseerd voor de bereiding van een monster voor cryo-FIBM uit een suspensie van de cellijn Saccharomyces cerevisiae stam BY4741 [ATCC 4040002] of soortgelijke stammen. Autoclaaf een erlenmeyer van 50 ml (of een soortgelijke kolf). Werk in een kap of laminaire flowbox. Pipetteer 10 ml van het groeimedium tot een steriele Erlenmeyer van 50 ml. Vul het medium aan met 1 ml gefilterde 20% glucose. Pluk een kolonie gist uit een agarplaat met een steriele, wegwerpinentingslus (1-10 μL). Plaats de Erlenmeyer in de couveuse en kweek bij 30 °C met roeren (150-200 tpm) totdat de exponentiële fase is bereikt (ongeveer 7 uur).OPMERKING: We hebben waargenomen dat de exponentiële fase wordt bereikt na ~ 15 uur wanneer kolonies worden geplukt van agarplaten die gedurende 4 weken bij omgevingstemperatuur zijn gekweekt. Zie ook Opmerking hieronder. Cultuur Saccharomyces cerevisiae op een agarplaat van glycerol stock. Gebruik een nieuwe agarplaat uit de opslag bij 4 °C. Neem de S. cerevisiae bouillon uit de -80 °C diepvriezer en plaats deze in een vriesstandaard om volledig ontdooien van de kolf te voorkomen. Schraap af en breng een kleine kweek met een steriele inentingslus (1-10 μL) over naar 50 μL groeimedium. Meng goed. Breng het hele volume van de gemengde S. cerevisiae-cultuur over en dispergeer met een steriele spreidstok over het oppervlak van de agarplaat. Incubeer bij 30 °C gedurende ongeveer 48 uur totdat kolonies met een diameter van 1,5-2 mm zijn gevormd.OPMERKING: Het is raadzaam om de kolonies vers te culineren voor het experiment. Kolonies ouder dan 1 week hebben een langere periode nodig voor de teelt in vloeibare media om de exponentiële groeifase te bereiken. Cultuur Saccharomyces cerevisiae op een agarplaat. Gebruik bereide agarplaten met gekweekte S. cerevisiae-kolonies. Pipetteer 10 ml steriel groeimedium en 1 ml gefilterde 20% glucose tot een Erlenmeyer van 50 ml. Kies een kolonie S. cerevisiae-cultuur met een steriele inentingslus en meng met een groeimedium in een kolf. Incubeer 50 minuten bij 30 °C met roeren (150-200 rpm). Verdun de suspensiecultuur tienmaal met het groeimedium en dispergeer 50 μL suspensie op een agarplaat met een steriele spreidstok. Incubeer bij 30 °C gedurende ongeveer 48 uur totdat 1,5-2 mm kolonies worden waargenomen. Wikkel de randen van de petrischaal met parafilm om te voorkomen dat deze uitdroogt. Bewaren bij kamertemperatuur en maximaal 4 weken gebruiken. Bereid Saccharomyces cerevisiae voor op bevriezing in celclusters. Bereid de S. cerevisiae-celkweek volgens het protocol in de sectie Teelt van Saccharomyces cerevisiae in suspensie (sectie 1.3) en incubeer ~ 7 h bij 30 °C met agitatie (150-200 rpm). Meet de OD van de S. cerevisiae celsuspensiecultuur bij 600 nm met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer. Concentreer de celsuspensie tot OD600 = 1. Bereid S. cerevisiae voor op bevriezing in een celmonolaag. Bereid S. cerevisiae celkweek volgens het protocol in de sectie Teelt van Saccharomyces cerevisiae suspensiecelcultuur en incubeer ~ 7 h bij 30 ° C met agitatie (150-200 rpm). Meet de OD van de S. cerevisiae celsuspensiecultuur bij 600 nm met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer. Breng de cellen in medium over naar de centrifugebuis en draai gedurende 2 minuten voorzichtig met een relatieve middelpuntvliedende kracht (900 x g). Gooi het medium uit de celkorrel door te pipetteren. Voeg vers medium toe aan de celkorrel. Bereken het volume van het medium om een celsuspensie van OD600 gelijk aan 30 tot 60 te krijgen. Voeg glycerol (50% stamoplossing) kort voor de vitrificatie toe aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 5%.OPMERKING: Glycerol werkt als een beschermend middel, dat de kwaliteit van het ijs in de regio’s tussen de cellen verbetert. Glycerol wordt pas kort voor vitrificatie aan cellen toegevoegd om de opname in de cel te minimaliseren. 2. Vitrificatie van het specimen Saccharomyces cerevisiae Gloeiende ontlading TEM-roosters met de koolstoffilmzijde naar boven gericht gedurende 30-45 s (druk: 6-9 Pa, stroom: 7 mA). Stel de vitrificatierobot in op de volgende parameters: temperatuur: 18 °C, vochtigheid: 100%, vlektijd: 6 s, wachttijd: 5 s, depcyclus: 1x en devlekkracht: 5.OPMERKING: Blotkracht is een instrumentspecifieke waarde en optimale blotkrachtwaarden kunnen verschillen tussen verschillende machines. De optimale waarde voor een bepaalde plunjer moet experimenteel worden bevestigd. Bereid vloeibaar ethaan voor vitrificatie. Monteer het niet-absorberende oppervlakkussen op het devlottkussen tegenover het monster. Gebruik het filtreerpapier voor het andere devlottkussen. Kies het gloeiende rooster met het pincet en monteer het pincet op het instrument voor het invriezen van de dompel. Breng 3,5 μL S. cerevisiae-suspensie aan op de koolstofzijde van het rooster in de klimaatkamer van de plunjer. Meng goed voor elke toepassing op het rooster. Vries het rooster in het vloeibare ethaan. Breng het rooster over van vloeibaar ethaan naar LN2. Bewaar roosters met verglaasde cellen onder LN2-omstandigheden of monteer ze in de TEM-rastercartridge om ze in de FIB-SEM-microscoop te laden. 3. TEM-roosters in de rastercartridge monteren OPMERKING: De hier beschreven workflow maakt gebruik van de TEM-rasters die in de rastercartridge zijn gemonteerd om de monsterverwerking en overdracht tussen SEM- en TEM-microscopen te vergemakkelijken. De cartridgeassemblage bestaat uit een C-ring, een TEM-raster en een C-clipring. Andere opties zijn beschikbaar bij het werken met instrumentatie van andere microscoopfabrikanten. Het grid cartridge assemblage werkstation is gevuld met LN2. Het LN2-niveau bedekt de rasterdoos met de TEM-rasters, maar de montage van de TEM-rasters in de cartridge wordt uitgevoerd in LN2-dampen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om tijdens de vitrificatieprocedure een beschermend mondkapje of schild te dragen om te voorkomen dat besmetting naar het monster ademt. Werk niet met de gereedschappen die zich hebben opgehoopt ijsverontreiniging. Zet het roostercartridge-montagewerkstation in elkaar en bereid droog gereedschap voor voor het knippen. Koel het montagewerkstation af met LN2. Koel de knipgereedschappen tot de LN2-temperatuur. Plaats een rasterdoos met een verglaasd monster in het montagewerkstation. Plaats een TEM-raster met het monster met cellen naar beneden gericht naar de C-ring en zet vast met een C-clip. Plaats de geknipte cartridges in de rasterdoos en sluit ze goed af. Bewaar cartridges in de LN2 Dewar of laad ze in de FIB-SEM microscoop. 4. Laden en manipuleren van het monster naar de FIB-SEM microscoop OPMERKING: De instructies zijn geschreven voor het gebruik van de dual-beam microscoop Versa 3D uitgerust met het PP3010 cryo-FIB / SEM-voorbereidingssysteem. Alternatieve oplossingen kunnen verschillende specifieke parameters vereisen; het algemene concept van de workflow moet echter nog steeds geldig zijn. Koel de microscoop af tot de temperatuur van vloeibare stikstof. Pomp de microscoopkamer en de bereidingskamer (indien aanwezig) naar een hoog vacuüm voordat u begint met afkoelen (< 4 x 10-4 Pa) om besmettingsgroei te voorkomen. Stel de stikstofgasstroom in op 5 l / min voor de voorbereidingskamer, microscoopfase en microscoop-anticontaminator. Wacht tot alle componenten een temperatuur van < -180 °C hebben bereikt.OPMERKING: De FIB-SEM-microscoopopstelling die in deze studie wordt gebruikt, maakt gebruik van gekoeld stikstofgas om het podium en de anticontaminator af te koelen. Andere systemen kunnen een andere methode gebruiken voor fasekoeling. De kamerdruk bereikt ~3 x 10-5 Pa zodra het podium en de anticontaminator zich op -190 °C op het hier gebruikte instrument bevinden. De groeisnelheid van de koolwaterstofvervuilende laag op het oppervlak van de lamellen met de experimentele opstelling die in deze studie wordt gebruikt, is ~ 15 nm / uur. Plaats de rasterpatroon met het monster in de microscoop. Monteer en koel het laadstation tot de LN2-temperatuur. Plaats de shuttle (monsterhouder), de rasterdoos met het monster, de rasterboxopener en het pincet in het gekoelde laadstation. Breng de roosterpatroon met het monster naar boven gericht voorzichtig over in de shuttle. Draai de shuttle in het laadstation naar de laadpositie. Laad in de microscoop. Optioneel, coat het monster met metalen beschermende lagen.OPMERKING: Een sterk opladend effect kan worden waargenomen bij het afbeelden van bevroren gehydrateerd biologisch materiaal SEM. Bovendien induceert het afbeelden van biologische monsters met FIB (zelfs bij lage stromen) snelle monsterschade. Daarom kan een extra coating van het monster worden uitgevoerd in de FIB-SEM-microscoop om het monsteroppervlak te beschermen. Deponeren van de beschermlaag met organometaal platina door het gasinjectiesysteem (GIS). Stel het monster in op de eucentrische hoogte (toevalspunt voor beeldvorming met elektronen en ionen). Kantel het podium terug naar 45° (monster 90° gekanteld ten opzichte van elektronenbundel). Verplaats het podium in de z-as4 mm onder de eucentrische hoogte. Stel de GIS-naald in op 26-30 °C. Zet ~300-1000 nm van de organometaal platinalaag af op het raster met het biologische specimen (komt overeen met 30-120 s van de GIS-depositie).OPMERKING: We passen meestal GIS toe voor 30 s voor monsters met kleine cellulaire clusters en 45 s voor monsters met een monolaag van de cellen. Sputtercoat het monsteroppervlak met een geleidende metaallaag. Zet ~10 nm van de metaallaag (Ir, Au, Pt) af op het rooster met een biologisch monster. Stel microscoopparameters in voor het lamellenpreparaat Gebruik voor FIB de volgende parameters: hoogspanning = 30 kV, stroom = 10 pA (beeldvorming), 10 pA–3 nA (FIB-frezen) Gebruik voor SEM de volgende parameters: hoogspanning = 2-5 kV, spotgrootte = 4,5, stroom = 8-27 pA. Stel de scanrotatie in op 180° voor beide balken. Stel de podiumkanteling in: freeshoek 6-11° (komt overeen met de fasekanteling van 13°-18° voor de sample shuttle met pre-tilt van 45° en FIB/SEM microscoop met 52° hoek tussen SEM en FIB kolom). 5. Bereiding van de Saccharomyces cerevisiae lamellen Controleer de rasterkwaliteit en selecteer een geschikt cluster van Saccharomyces cerevisiae. Controleer of het TEM-raster van beide kanten goed is uitgeveegd zonder extra water rond het celcluster of aan de achterkant van het raster.OPMERKING: Om de achterkant van het raster te controleren, draait u het werkgebied naar -10° en beeldt u het raster uit met FIB. Selecteer de optimale celclusters voor lamellenpreparaat volgens de volgende aanbevelingen. Plaats de celclusters in het rastercentrum. Het freesgebied mag zich niet buiten het vierkant uitstrekken met afmetingen van 1100 x 1100 μm in het midden van het raster (550 μm in elke richting van het rastercentrum). Plaats de celclusters in het centrale deel van het rastervierkant zonder overlap met de rasterbalk. Plaats de celclusters in het raster vierkant met compacte gatachtige koolstoffolie zonder scheuren. Zorg ervoor dat het cluster niet omgeven is door ijsverontreiniging. Selecteer de optimale freespositie in de Saccharomyces cerevisiae monolaag. Zorg ervoor dat de rasterbalken rond de celmonolaag op het geselecteerde rastervierkant zichtbaar zijn. Selecteer de optimale positie in de cellulaire monolaag volgens de volgende aanbevelingen. De geselecteerde maalgebieden moeten aan de volgende criteria voldoen: Heb de regio van belang in het rastercentrum. Het freesgebied mag zich niet uitstrekken buiten het kwadraat van afmetingen 1100 x 1100 μm in het rastercentrum (550 μm in elke richting van het midden van het raster). Zorg ervoor dat het interessante gebied in het centrale deel van het rastervierkant ligt zonder overlap met de rasterbalk. Omring de celmonolaag niet met ijsverontreiniging. Bereid S. cerevisiae lamellen met cryo-FIB.OPMERKING: Het freespatroon wordt gegenereerd en gecentreerd ten opzichte van het gebied van interesse. Cryo-FIBM wordt sequentieel uitgevoerd met meerdere freesstappen die worden uitgevoerd bij verschillende FIB-instellingen. De lamellen met een dikte van ongeveer 2 μm worden in eerste instantie gefreesd met behulp van hoge stroom (0,3-3 nA). De lamellen worden dan geleidelijk uitgedund tot 500 nm. De fijnfresstap bij lage stromen (10-30 pA) wordt gebruikt om de lamellen af te ronden tot ~ 100-200 nm dikte. Stel een interessegebied (ROI) in op de eucentrische hoogte en sla deze positie op.OPMERKING: Het toevalspunt moet voor elke positie afzonderlijk worden bepaald en opgeslagen. De eucentrische hoogte wordt ingesteld door het podium naar 0° te kantelen en de ROI te centreren door het podium in de x- en y-richting te bewegen. Het podium wordt vervolgens gekanteld tot 25° en de ROI wordt teruggebracht naar het midden van het gescande gebied door de positie van de z-asvan het podium te wijzigen. Ten slotte wordt het podium teruggekantld naar 13° -18° voor frezen. Definieer een rechthoekig freespatroon boven de ROI met een scanrichting van boven naar beneden. Definieer een rechthoekig freespatroon onder de ROI met een scanrichting van onder naar boven. Definieer het inactieve rechthoekige freespatroon dat het betreffende gebied bestrijkt voor een ruwe schatting van de lamellendikte. Dit patroon wordt niet gemalen tijdens de bereiding van lamellen. Markeer alle patronen en stel de lamellenbreedte(x dimensie) in. De breedte van het freespatroon mag niet groter zijn dan 2/3 van de clusterbreedte. Dit komt in de meeste gevallen overeen met 8-15 μm. Parameters instellen voor ruwe freesstappen FIB-stroom: 0,3-3,0 nA; uiteindelijke lamellendikte: 1,5-2 μm; breedte van het FIBM-gebied: 8-12 um; podium-kanteling: 13-17 °; duur: 8 minuten; actieve freespatronen: boven en onder. FIB-stroom: 0,3-1,0 nA; uiteindelijke lamellendikte: 1 μm; breedte van het FIBM-gebied: 7,5-11,5 μm; podium-kanteling: 13-17 °; duur: 8 minuten; actieve freespatronen: boven en onder. FIB-stroom: 100-300 pA; uiteindelijke lamellendikte: 0,5 μm ; breedte van het FIBM-gebied: 7,5-11,5 μm; podium-kanteling: 13-17 °; duur: 8 minuten; actieve freespatronen: boven en onder. FIB-stroom: 30-100 pA; uiteindelijke lamellendikte: 0,3 μm ; breedte van het FIBM-gebied: 7,5-11,5 μm; podium-kanteling: 13-17 °; duur: 8 minuten; actieve freespatronen: boven en onder. Stel parameters in voor de fijnfreesstap: FIB-stroom: 10-30 pA; uiteindelijke lamellendikte: <0,2 um; breedte van het FIBM-gebied: 7-11 μm; podium-kanteling: 13-17 ° (+1 °); duur: 12 minuten; actieve freespatronen: bovenwerk.OPMERKING: De ruwe freesstappen (5.3.6) worden voor elke lamellen achtereenvolgens uitgevoerd. Daarentegen volgt de fijne maalstap (5.3.7) niet direct het ruwe frezen, maar worden fijne maalstappen sequentieel uitgevoerd voor alle lamellen aan het einde van de sessie om de koolwaterstofverontreiniging op het lamellenoppervlak te minimaliseren. Een extra +1° trapkanteling wordt gebruikt tijdens het fijnfrezen om de uniformiteit van de lamellendikte over de lengte te vergroten. 6. Overdracht van Saccharomyces cerevisiae lamellen naar cryo-TEM Bereid een goed gedroogde Dewar en vul deze met LN2. Ontlaad de monsters met lamellen uit de FIB/SEM-microscoop onder cryo-omstandigheden, breng ze over naar een rasterdoos en bewaar ze in een LN2-opslag Dewar voor langdurige opslag. U kunt de roosters ook rechtstreeks in cryo-TEM laden. De juiste oriëntatie van de lamellen ten opzichte van de cryo-TEM-fase kantelas is belangrijk (zie begeleidende video om 8:10 voor meer details). Zorg ervoor dat de freesrichting van geprepareerde lamellen loodrecht staat op de cryo-TEM-trap kantelas. Kantel de cryo-TEM-trap vooraf om de lamellenkanteling ten opzichte van het rastervlak te compenseren en de kantelreeks te verzamelen met behulp van een dosissymmetrisch schema19.OPMERKING: De grootte van de voorkanteling (meestal 6-8°) wordt bepaald door de hoek tussen het TEM-rastervlak en de FIB-richting tijdens micromachining. De positie van de lamellenvoorrand in het beeld in cryo-TEM kan worden gebruikt om het teken van de pre-tilt hoek te bepalen. Daarvoor moet de zin van de microscooptraprotatie bekend zijn. In onze experimentele opstelling komt de positie van de voorrand van de lamellen aan de rechterkant van de foto die in nanoprobe SA-modus is gemaakt overeen met negatieve pre-tilt.

Representative Results

De Saccharomyces cerevisiae-cultuur werd geoogst in het midden van de exponentiële groeifase. We bereidden twee soorten monsters voor waarbij de cellen ofwel als kleine clusters van verschillende cellen over het oppervlak van het TEM-raster werden verdeeld (Figuur 1A, C) of een continue monolaag vormden over individuele rastervierkanten van het TEM-raster ( Figuur1B,D). De discriminerende factor voor de bereiding van het monster met afzonderlijke cel eilandjes of de cellulaire monolaag is de concentratie van de celcultuur die op het TEM-raster wordt toegepast. De geoogste celkweek werd geconcentreerd op respectievelijk OD600 = 1,0 voor het eerste geval, of op OD600 = 30 tot 60 voor het laatste geval. Het monster voor de bereiding van de cellulaire monolaag werd verder aangevuld met 5% v/v glycerol voorafgaand aan vitrificatie. De glycerol is van cruciaal belang voor de verglazing van de bufferoplossing, die de ruimte tussen de cellen vult(figuur 2),omdat de reflecties van de kristallijne buffer schadelijk kunnen zijn voor een goede positionele tracking en focus tijdens cryo-ET-gegevensverzameling. Bovendien werd de gistsuspensiecultuur afgeveegd tegen het niet-absorberende materiaal zoals de PTFE-deegpad of de aangepaste 3D-geprinte pad gemaakt van FlexFill 98A-materiaal. Het vloeipapier werd alleen aan de achterkant van het rooster geplaatst ten opzichte van de monstertoepassing (back-blotting). De back-blotting-strategie wordt aanbevolen voor de suspensiecultuur die bevriest, omdat het depen met het filterpapier van beide zijden resulteert in hechting van de cellen aan het vloeipapier (figuur 1E). Het hier beschreven protocol maakt gebruik van TEM-rasters die in de rastercartridge zijn geknipt, wat een stabiele ondersteuning voor het raster vormt en de monsterverwerking van het monster na de vitrificatie vergemakkelijkt. Dit dwingt een noodzaak af dat andere monsterhouders en shuttles in FIB / SEM en TEM-microscoop een dergelijke rastercartridge kunnen accepteren. Na overdracht van het monster in de FIB/SEM-microscoop werd het monster eerst gecoat met een laag methylcyclopentadienyl platina van 0,3-1,0 μm met behulp van het microscoopgasinjectiesysteem (GIS). Een extra laag van het anorganische iridium werd gesputterd op het monsteroppervlak om de GIS-laag uit te harden en het oppervlak geleidend te maken. De lamellen werden in meerdere stappen gemalen(figuur 3)waarbij (I) de maalstroom, (II) de lamellenbreedte en (III) de afstand van het freesgebied boven en onder de monsters stapsgewijs werden verkleind. De laatste freesstap (“polijsten”) werd uitgevoerd bij lage stroom (10-30 pA) alleen vanaf de bovenzijde van de lamellen en met het monster met nog eens 1° schuin naar de Ga+ balk. Het gebruik van het beschreven protocol heeft gemiddeld geresulteerd in 8-10 lamellen bereid op twee TEM-roosters binnen één sessie van 6-8 uur. De TEM-roosters met de lamellen werden vervolgens overgebracht in een transmissie-elektronenmicroscoop. De lamellen werden eerst gescreend en alleen die met minimale gordijnen (artefacten als gevolg van ongelijk frezen over het lamellenoppervlak), laag oppervlakteverontreinigingsniveau en goed cellulair contrast (meestal waargenomen voor lamellen met <200 nm dikte) werden geselecteerd voor de verwerving van de cryo-ET-gegevens. Bovendien werden lamellen met scheuren over de hele lengte weggegooid uit de gegevensverzameling. Over het algemeen was ongeveer 50% van de lamellen die naar TEM werden overgebracht geschikt voor data-acquisitie. Tilt-series werden verzameld op de post-GIF K2 directe elektronendetector met de energieselectieve spleet ingesteld op 20 eV. De gegevensverzameling werd uitgevoerd in SerialEM-software18 en de kantelreeksen werden verzameld met behulp van een dosissymmetrisch schema19 met het kantelbereik van ±60° en de toename van 3°. De gegevens werden verkregen bij de vergroting die overeenkomt met de pixelgrootte van 3,47 A /px. De totale dosis van 65e/Å 2 werd gelijkmatig verdeeld over de afzonderlijke subframes. De kantelbeelden werden verzameld als een set van drie frames, die vervolgens werden gecorrigeerd voor de bewegings- en stralingsschade tijdens gegevensverzameling met behulp van het MotionCor220-programma. Parameters van de contrastoverdrachtsfunctie werden geschat met behulp van Ctffind421. De kantelseries zijn verwerkt in eTomo18. De patch tracking routine werd gebruikt om de beelden uit te lijnen. Het tomogram werd gereconstrueerd met behulp van een verzwaard terugprojectiealgoritme na 2x binning van de afbeeldingen, en vervolgens gefilterd met behulp van SIRT-achtig filter (ingesteld op 8 iteraties) in IMOD18. De tomogramsegmentatie werd handmatig uitgevoerd in Amira software22. De gereconstrueerde tomogrammen bieden een hoge resolutie weergave van het cellulaire binnenste van de gist en stellen ons in staat om organellen zoals vacuolen of mitochondriën op een hoog detailniveau te observeren of macromoleculaire complexen zoals microtubuli of nucleaire poriecomplexen in situ en onder near-native omstandigheden te bestuderen (Figuur 4). Figuur 1: FIB- en SEM-beelden van verglaasde S. cerevisiaeFIB (A) en SEM (C) beelden van de kleine gistclusters die op het TEM-raster worden verglaasd. FIB (B) en SEM (D) beelden van de gist die een continue monolaag vormt op het rasteroppervlak. Het monster werd gecoat met GIS- en Irridium-laag voordat het werd gebeeld. De schaalbalken in panelen A-B komt overeen met 10 μm. Het gistmonster wordt afgeveegd tegen niet-absorberend materiaal zoals PTFE of FlexFill 98A (groen) en met het vloeipapier vanaf de achterkant van het rooster (wit, E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: S. cerevisiae lamellenEen TEM-afbeelding van een lamellen micromachine uit het monster met continue monolaag gist over het roosteroppervlak. De waargenomen reflecties tussen de cellen bevatten onjuist verglaasd medium/buffer(A,gemarkeerd met rode cirkels). Een TEM-afbeelding van lamellen gegenereerd op de gist verglaasd in een continue monolaag met de toevoeging van 5% glycerol in het medium / buffer (B). Schaalbalk komt overeen met 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Cryo-FIBM workflowSchematische weergave van het lamellen maalproces. De eerste ruwe freesstappen worden uitgevoerd bij hoge FIB-stromen aan beide zijden van de voorlopige lamellenpositie (groen gemarkeerd), terwijl de laatste polijststap alleen vanaf de bovenzijde en bij een lage FIB-stroom wordt uitgevoerd (oranje gemarkeerd, zie begeleidende video om 6:33). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Gistorganellen en macromoleculaire complexen afgebeeld door cryo-ETPlakjes van de gereconstrueerde tomogrammen met een vacuole (A, schaalbalk: 200 nm), ribosomen (B, schaalbalk: 200 nm), een parakristallijne kern van peroxisoom (C, schaalbalk: 100 nm), microtubule (witte pijl) in de nabijheid van ongeïdentificeerde vezelstructuur (zwarte pijl, D, schaalbalk: 100 nm), details van meerdere microtubuli (E, schaalbalk: 50 nm), een kernmembraan met poriën aangegeven door pijlen (F, schaalbalk 200nm), mitochondrion (G, H, schaalbalk: 100 nm, de pijlen geven individuele cristae aan), een bundel van ongeïdentificeerde filamenteuze structuren (I, schaalbalk: 100 nm). Panelen B, C, D, E, G bevatten een sectie van tomogrammen bereid uit kleine clusters van cellen, terwijl de secties van tomogrammen verzameld op lamellen uit een monolaag van de cellen worden weergegeven in panelen A, F, H, I. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De voorbereiding van de cellulaire monsters voor cryo-ET is een complexe workflow die het gebruik van verschillende high-end instrumenten vereist. De monsterkwaliteit kan worden aangetast tijdens elke voorbereidingsstap die de doorvoer van het hele protocol beïnvloedt. Bovendien vormt de noodzaak van de monsteroverdracht tussen afzonderlijke instrumenten een extra risico op verontreiniging of devitrificatie van het monster. Daarom is optimalisatie van individuele stappen in de monstervoorbereidingsworkflow van groot belang om de doorvoer en reproduceerbaarheid van de lamellenvoorbereidingsworkflow te verhogen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de geoptimaliseerde bereiding van Saccharomyces cerevisiae voor structurele karakterisering van macromoleculaire complexen in situ door cryo-ET.

Het protocol beschrijft de bereiding van twee soorten gistmonsters die voornamelijk verschillen in de concentratie van de cellen op het TEM-raster. Beide gistmonsters leverden hoogwaardige lamellen op voor cryo-ET en selectie van het monstertype kan worden gemaakt in overeenstemming met de doelstellingen van de specifieke studie. De gist vormt geïsoleerde clusters van enkele cellen die in het eerste geval willekeurig over het rasteroppervlak zijn verspreid, terwijl een continue monolaag van cellen aanwezig is op het TEM-rasteroppervlak voor het tweede monstertype. De eerste is geschikt voor snelle lamellenbereiding dankzij het kleine volume van het materiaal dat moet worden weggefreesd. De uiteindelijke lamellen zijn vrij kort en bevatten daarom slechts 2-4 cellulaire doorsneden. De gebieden die geschikt zijn voor monstervoorbereiding zijn willekeurig verdeeld over het rasteroppervlak, inclusief de rastervierkanten, wat de automatisering van de lamellenvoorbereidingsworkflow gedeeltelijk kan beperken. Het laatste type monster vereist het gebruik van grotere stromen tijdens de eerste maalfase om de totale freestijd te behouden. Bovendien is dit type monster meer vatbaar voor artefacten die voortkomen uit ongelijk frezen (gordijnen). Daarom wordt GIS gedurende een 50% langere periode op het monsteroppervlak gesputterd dan in het geval van het monster met kleine cellulaire clusters om een dikkere beschermende laag te vormen. Vervolgens wordt het monster gesputterd met een extra laag Iridium (alternatief platina of goud) om de GIS-laag uit te harden, stijver te maken en de geleidbaarheid van het monsteroppervlak te verhogen. FIBM van extra gebieden aan elke kant van de lamellen (~ 2-5 μm van de lamellenrand) tijdens de eerste stap van het ruwe lamellenfrezen werd gunstig bevonden om het aantal gebroken lamellen te verminderen, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van verminderde spanning in de laatste doorsnede23. De laatste lamellen zijn lang en bevatten ~ 10 cellulaire doorsneden, waardoor het aantal regio’s dat geschikt is voor cryo-ET toeneemt. De onjuiste vitrificatie van het medium of de buffer tussen de cellen kan gemakkelijk worden verzwakt door de toevoeging van de cryo-protectant aan de bufferoplossing (5% glycerol gebruikt in deze studie). Omdat de meeste vierkanten geschikt zijn voor lamellenpreparaat, is het monster met cellen georganiseerd in een continue monolaag zeer geschikt voor lamellenpreparaat zonder toezicht.

Een ander belangrijk aspect in de lamellenvoorbereidingsworkflow is de overdracht naar de transmissie-elektronenmicroscoop en de juiste positionering van de lamellen naar de kantelas van de microscooptrap. Optimaal staat de hoofdas van de lamellen loodrecht op de kantelas van de microscoop, wat het volgen en scherpstellen op de hoogte van het afgebeelde gebied biedt en voorkomt dat de lamellenranden het gezichtsveld bij hoge kantelhoeken afschermen. Bij het verzamelen van de cryo-ET-gegevens met behulp van het dosissymmetrische schema18 moet het monster in eerste instantie in de microscoop worden gedraaid om de kanteling van de lamellen ten opzichte van het rastervlak te compenseren.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie, en de CIISB-onderzoeksinfrastructuur, een Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Wij erkennen de steun van Thermo Fisher Scientific Brno.

Materials

Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
  2. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
  3. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
  4. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  5. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  6. Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  7. O’Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
  8. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
  9. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
  10. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
  11. Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
  12. Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
  13. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
  14. Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
  15. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
  18. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  19. Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
  20. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  21. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
  22. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -. C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
  23. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Tags

Saccharomyces CerevisiaeCryo-electron TomographyCell CultivationSterile ConditionsLaminar Flow BoxYeast Extract MediumGlucoseExponential PhaseOD MeasurementGlycerolPlasma CleaningGlow DischargingVitrobotBlottingLiquid EthaneVitrification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image