冷冻电子断层扫描 的糖核 酸的准备和冷冻-FIB微加工

1. 培养和制备 糖体细胞 ，用于化 为 糖精切塞雷维西亚准备液体生长介质。 自动将一个 500 mL 玻璃瓶用于制备生长介质。 重2.2克酵母提取物（1.1%）和4.4克Peptone（2.2%），混合在200ml的水中。 在 121 °C 下自动夹紧 15 分钟进行消毒。 重10克葡萄糖粉，混合在50mL的水，以获得20%的葡萄糖溶液。通过 0.2 μm 过滤器传递解决方案，并将它存储在 4 °C 下。 为 圣餐切西雷维西亚准备固体介质。 重4克的醋粉，与200ml的生长介质混合。 在 121 °C 的高压灭菌中消毒 15 分钟。 冷却介质至 40-50 °C，并添加 20 mL 的 20% 无菌葡萄糖（前一步准备）。将整个介质的 ±20 mL 倒入培养皿中，使其在环境温度下凝固。 将茄子板包裹在副膜中，以防止干燥，并在 4 °C 下存放。 文化 圣餐在 暂停注：该协议是优化的，以准备从暂停的细胞线 S丙烯酸酯脑层 菌株BUB4741 [ATCC 4040002]或类似的菌株的低温-FIBM样品。 高压灭菌 50 mL 埃伦迈尔 （或类似） 烧瓶。 在引擎盖或层压流箱中工作。皮佩特 10 mL 的生长介质到无菌 50 mL 埃伦迈尔烧瓶。 用1 mL过滤20%葡萄糖补充介质。从带有无菌一次性接种环（1-10 μL）的亚加板中挑选一团酵母。 将 Erlenmeyer 烧瓶放在孵化器和文化中，在 30 °C 处搅拌（150-200 rpm），直到达到指数阶段（约 7 小时）。注：我们观察到，当从在环境温度下培养了 4 周的人造黄油板中采摘菌落时，指数阶段在 ±15 小时后达到。另请参阅下面注释。 文化糖精从甘油库存的阿加板上切除。 使用 4 °C 存储中的新加糖板。 从 -80 °C 的深冰柜中取出 S. Cerevisiae 库存，并将其放入冷冻支架中，以避免库存完全解冻。 刮掉并转移具有无菌接种循环（1-10 μL）到 50 μL 生长介质的小培养物。正确混合。 将混合 的塞雷维西亚 文化的整个体积转移，并用无菌的蔓延棒在阿加板表面分散。 在 30 °C 下孵育约 48 小时，直到形成直径为 1.5-2 mm 的菌落。注：建议在实验前对殖民地进行新培养。超过1周的菌落需要较长时间的液体介质培养才能达到指数增长阶段。 文化 糖精在 阿加盘子里。 使用预制的阿加板与种植 的塞雷维西亚 殖民地。 派佩特 10 mL 的无菌生长介质和 1 mL 过滤 20% 葡萄糖到 50 mL 埃伦迈尔烧瓶。 选择一个带有无菌接种循环的 S. cerevisiae 培养物的殖民地，并与烧瓶中的生长介质混合。 在 30 °C 下孵育 50 分钟，搅拌（150-200 转转）。 用生长介质稀释悬浮培养物十次，用无菌扩散棒将 50 μL 的悬浮物分散在茄板上。 在30°C下孵育约48小时，直到观察到1.5-2毫米菌落。 用副膜包裹培养皿的边缘，以防止其干燥。在室温下存放，最多使用4周。 准备 糖精切塞雷维西亚 在细胞簇中暴跌冻结。 根据暂停（第 1.3 节）中糖核酸培养部分的协议准备S. cerevisiae细胞培养，并在 30 °C 下以激动（150-200 rpm）孵育 +7 h。 使用紫外线/Vis 光谱仪测量 600 nm 的 S. cerevisiae 细胞悬浮培养的 OD。 将细胞悬架集中到 OD600 = 1。 准备 S. 塞雷维西亚 在细胞单层中暴跌冻结。 根据糖核酸细胞培养部分的规程准备S. Cerevisiae细胞培养，并在 30 °C 下以激动（150-200 rpm）孵育 +7 h。 使用紫外线/Vis 光谱仪测量 600 nm 的 S. cerevisiae 细胞悬浮培养的 OD。 将中等细胞转移到离心机管中，以相对离心力（900 x g）轻轻旋转2分钟。 通过管道将介质从细胞颗粒中丢弃。 在细胞颗粒中加入新鲜的介质。计算介质体积，获得OD600 的细胞悬浮，等于30至60。 在细胞悬浮中加入甘油（50% 库存溶液），在玻璃化前不久最终浓度达到 5%。注：甘油作为保护剂，可提高细胞之间区域的冰的质量。甘油被添加到细胞中，直到玻璃化前不久，以尽量减少其吸收到细胞。 2. 萨 查罗米切斯塞雷维西亚 标本的维他化 发光放电 TEM 网格，碳膜侧朝上 30-45 s（压力：6-9 Pa，电流：7 mA）。 将 Vitr 化机器人设置为以下参数：温度：18 °C，湿度：100%，污点时间：6s，等待时间：5s，印迹周期：1倍，污点力：5。注：斑点力是一种特定于仪器的值，不同机器之间可能有不同的最佳斑点力值。特定柱塞的最佳值必须通过实验确认。 准备液体乙烷进行化。 将非吸水表面垫安装到面向样品的印迹垫上。将滤纸用于其他印迹垫。 用钳子拾取发光放电网格，并将钳子安装到跳水冷冻仪器上。 将 3.5 微升 S. cerevisiae 悬浮件应用于柱塞气候室内电网的碳侧。在网格上的每个应用程序之前正确混合。 将网格冻结到液态乙烷中。 将网格从液态乙烷转移到LN2。在 LN2 条件下存储带细化细胞的网格，或将其安装到 TEM 网格墨盒中，以加载到 FIB-SEM 显微镜中。 3. 将 TEM 网格安装到网格墨盒中 注：此处描述的工作流程利用安装在网格墨盒中的 TEM 网格，以方便 SEM 和 TEM 显微镜之间的样品处理和传输。墨盒组件由 C 环、TEM 网格和 C 夹环组成。使用其他显微镜制造商的仪器时，还有其他选择。网格墨盒装配工作站充满了 LN2。LN2 级别用 TEM 网格覆盖网格盒，但将 TEM 网格安装到墨盒中是在 LN2 蒸汽中执行的。强烈建议在病毒化过程中佩戴保护面罩或防护罩，以防止污染对标本的呼吸。不要使用累积冰污染的工具。 将网格墨盒装配工作站放在一起，并准备用于剪报的干工具。 用 LN2冷却装配工作站。将剪贴工具冷却至 LN2 温度。 将带有体格样品的网格盒放入装配工作站。 放置一个 TEM 网格，标本的细胞朝下到 C 环，然后用 C 夹固定。 将夹紧的墨盒放入网格盒中并正确关闭。 将墨盒存放在 LN2 德瓦尔或将其加载到 FIB-SEM 显微镜中。 4. 将样品加载和操作到 FIB-SEM 显微镜 注：编写了用于使用双光束显微镜 Versa 3D 的说明，该显微镜配备了 PP3010 低温-FIB/SEM 制备系统。替代解决方案可能需要不同的特定参数;但是，工作流程的总体概念仍然有效。 将显微镜冷却到液氮温度。 冷却开始前将显微镜室和制备室（如果存在）泵送至高真空（< 4 x 10-4 Pa），以防止污染增长。 将氮气流量设置为 5 L/min，用于制备室、显微镜阶段和显微镜防污染器。等待，直到所有组件达到< -180 °C 的温度。注：本研究中使用的FIB-SEM显微镜设置利用冷却的氮气冷却其阶段和防污染剂。其他系统可能使用不同的方法进行阶段冷却。一旦舞台和防污染器位于此处使用的仪器上的 -190 °C，腔室压力达到 +3 x 10-5 Pa。本研究中使用的实验设置中，拉梅拉表面碳氢化合物污染层的生长速度为 ±15 nm/小时。 将带标本的网格墨盒加载到显微镜上。 将装载站组装并冷却至 LN2 温度。 将穿梭机（样品支架）、带标本的网格盒、网格盒开瓶器和钳子放入冷却装载站。 小心地将网格盒与标本朝上转移到航天飞机上。 将装载站内的穿梭车翻转到装载位置。 装入显微镜。 可选，为标本涂上金属保护层。注：当成像冷冻水合生物材料SEM时，可以观察到强烈的充电效果。此外，使用 FIB 成像生物样品（即使在低电流下）会诱发快速的样品损伤。因此，在 FIB-SEM 显微镜内可以进行额外的样品涂层，以保护标本表面。 气体喷射系统 （GIS） 将保护层与有机铂沉积。 将样品设置为以欧为中心的高度（电子和离子成像的巧合点）。 将舞台向后倾斜至 45°（相对于电子束倾斜 90°）。 将 z 轴中的舞台移动到 4 mm 以下的 eu 中心高度。 将 GIS 针设置为 26+30 °C。 将 300-1000 nm 的有机铂层与生物标本（相当于 GIS 沉积物的 30+120 s）一起沉积到网格中。注：我们通常应用GIS为30s的样本与小细胞簇和45s的样本与细胞的单层。 溅射物用导电金属层涂抹标本表面。 用生物标本将 10 纳米的金属层（Ir、Au、Pt）沉积到网格中。 为拉梅拉制备设置显微镜参数 对于 FIB，请使用以下参数：高压 = 30 kV，电流 = 10 pA（成像），10 pA+3 nA （FIB 铣削） 对于 SEM，请使用以下参数：高压 = 2+5 kV，点大小 = 4.5，电流 = 8+27 pA。 将两个光束的扫描旋转设置为 180°。 设置舞台倾斜度：铣削角度 6-11°（对应 13°18° 的舞台倾斜，用于预倾斜 45° 的样品穿梭和在 SEM 和 FIB 列之间具有 52° 角度的 FIB/SEM 显微镜）。 5. 准备 圣餐切丽舍·拉梅拉 检查网格质量，并选择合适的糖精集群。 检查 TEM 网格是否从两侧正确擦除，而细胞群周围或网格后侧没有额外的水。注：为了检查网格的背面，将舞台旋转到 -10°，然后用 FIB 对网格进行成像。 根据以下建议选择最佳细胞组进行拉梅拉制备。 将单元格组放置在网格中心。铣削区域不应延伸到正方形外，尺寸为 1100 x 1100 μm，位于网格中心（从网格中心向每个方向扩展 550 μm）。 将单元格聚类放置在网格方块的中心部分，与网格条没有重叠。 将电池簇放置在网格方块中，用紧凑的孔碳箔，无裂缝。 确保聚类不会被冰污染包围。 选择 糖浆切片单 层的最佳铣削位置。 确保选定网格正方形上的单元格单层周围的网格条可见。 根据以下建议选择细胞单层的最佳位置。选定的铣削区域应满足以下标准： 在网格中心拥有感兴趣的区域。铣削区域不应延伸到位于网格中心的尺寸 1100 x 1100 μm 的正方形之外（从网格中心向每个方向延伸 550 μm）。 在网格方块的中央部分有感兴趣的区域，与网格条没有重叠。 不要将细胞单层包围在冰污染中。 准备 S. 塞雷维西亚 拉梅拉与低温 – Fib 。注：铣削模式相对于感兴趣区域生成并以中心为中心。冷冻-FIBM 按顺序执行，在不同的 FIB 设置下执行多个铣削步骤。厚度约为 2 μm 的拉梅拉最初使用高电流 （0.3 3 nA） 进行铣削。然后，拉梅拉逐渐变薄到500纳米。低电流（10-30 pA）的精细铣削步骤用于将拉梅拉最终确定为 ±100+200 nm 厚度。 将感兴趣的区域 （ROI） 设置为以 eu 中心高度为中心，并保存此位置。注：需要分别确定和保存每个位置的巧合点。以欧心高度为设置，将舞台倾斜至 0°，并通过在 x 和 y 方向移动舞台来以 ROI 为中心。然后将舞台倾斜至 25°，通过更改阶段 z轴位置将投资回报率带回扫描区域的中心。最后，舞台向后倾斜至 13°+18° 进行铣削。 使用从上到下的扫描方向定义 ROI 上方的矩形铣削模式。 使用从下到上扫描方向定义 ROI 下方的矩形铣削模式。 定义覆盖感兴趣区域的非活动矩形铣削模式，粗略估计拉梅拉厚度。这种模式不是在拉梅拉准备过程中磨制的。 标记所有图案并设置拉梅拉宽度（x 维度）。铣削模式的宽度不应超过聚类宽度的 2/3。在大多数情况下，这相当于 8°15 μm。 为粗加工步骤设置参数 FIB 电流： 0.3+3.0 nA：最后的拉梅拉厚度： 1.5+2 μm;FIBM 区域的宽度： 8-12 um：舞台倾斜： 13-17°;持续时间：8分钟：主动铣削模式：上部和下部。 FIB 电流： 0.3+1.0 nA;最后的拉梅拉厚度：1微米;FIBM 面积宽度：7.5-11.5 μm;舞台倾斜： 13-17°;持续时间：8分钟：主动铣削模式：上部和下部。 FIB 电流： 100+300 pA;最后的拉梅拉厚度：0.5μm：FIBM 面积宽度：7.5-11.5 μm;舞台倾斜： 13-17°;持续时间：8分钟：主动铣削模式：上部和下部。 FIB 电流： 30+100 pA;最后的拉梅拉厚度：0.3μm：FIBM 面积宽度：7.5-11.5 μm;舞台倾斜： 13-17°;持续时间：8分钟：主动铣削模式：上部和下部。 为精细铣削步骤设置参数： FIB 电流： 10+30 pA;最后的拉梅拉厚度：<0.2 um：FIBM 区域的宽度：7-11 μm;舞台倾斜： 13-17° （+1°）;持续时间：12分钟;主动铣削模式：上部。注：粗铣削步骤（5.3.6）按顺序为每个拉梅拉进行。相比之下，精细铣削步（5.3.7）并不直接遵循粗加工，但精细铣削步骤在会话结束时会连续执行所有拉梅拉，以尽量减少拉梅拉表面的碳氢化合物污染。在精细铣削步骤中，使用额外的 +1° 阶段倾斜，以增加拉梅拉厚度的均匀性。 6. 将 糖精切塞雷维西亚 拉梅拉转移到低温 – Tem 准备一个适当干燥的德瓦尔，并填补它与LN2。 在低温条件下，用从 FIB/SEM 显微镜中取出带有跛脚的样品，将其转移到网格盒中，并储存在 LN2 存储 Dewar 中，以便长期存储。或者，将网格直接加载到低温-TEM 中。 拉梅拉相对于低温-TEM 舞台倾斜轴的正确方向很重要（请参阅 8：10 的随附视频，了解更多详情）。确保制备拉梅拉的铣削方向与低温-TEM 舞台倾斜轴垂直。 预倾斜低温-TEM阶段，以补偿拉梅拉倾斜相对于网格平面，并收集倾斜系列使用剂量对称方案19。注：预倾斜（通常为 6+8°）的大小由 TEM 网格平面和 FIB 方向在微加工过程中的角度决定。拉梅拉前缘在图像中的位置在低温-TEM中可用于确定预倾斜角度的标志。为此，必须知道显微镜阶段旋转的感觉。在我们的实验设置中，在纳米probe SA 模式拍摄的图像右侧的拉梅拉前缘位置对应于负预倾斜。