クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

急落凍結のための熱帯熱マラリア原虫の準備 化合物2およびE64阻害剤は、出口の異なる段階でシゾントを失速させるために使用され、その後の研究のために豊富なシゾントの集団を生成する。相補的な相関技術がなければ、プロセスが本質的に盲目であるため、特定の細胞内ターゲットまたは細胞タイプの粉砕が困難であるため、これは重要です。化合物2は、液胞破裂の前に退出を停止するプロテインキナーゼ阻害剤である。シゾントは化合物2上で4時間同期し、次いで化合物2を含まない培地で洗浄して阻害剤を除去することができ、その時点でシゾントは約30分後に成熟して排出されます。あるいは、化合物2同期シゾントを不可逆的な広域スペクトルシステインプロテアーゼ阻害剤であるE64に洗浄し、液胞破裂点後、宿主細胞破裂前に約1時間インキュベートして退去を停止させることができます。処理されたシゾントの形態と均質性は、急落凍結の前にギムザ染色血液塗抹標本によってチェックする必要があります(図1)。シゾントは、この公報に記載されている方法を使用して、これらの状態のいずれかで急降下凍結することができます。 図1:ギムザ染色血液塗抹標本による化合物2およびE64失速 した熱帯熱マラリア原虫 の形態。 (A)化合物2の存在下で、寄生性液胞(PV)は、ヘモゾイン結晶の単一のクラスター(暗褐色の円)を有するメロゾイト(紫色の円)で密集している。宿主赤血球(hRBC)(灰色のバンド)におけるPVと周囲のヘモグロビンとの間の境界は、hRBC膜と同様に明確に定義されている。(B)E64の存在下では、PV膜が破裂し、メロゾイトがhRBC内に広がります。各シゾントはまだヘモゾイン結晶の単一のクラスターを含んでいます。宿主細胞膜は漏出性があり、部分的に崩壊しているため、細胞周辺にはヘモグロビンは見えず、hRBC膜の境界は容易に見えません。スケールバー、5 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 プランジ凍結の最適化熱帯熱マラリア原虫感染赤血球のブロッティング条件の最適化中に、金および銅の200メッシュグリッド上の2/2、3/3、3.5/1、および5/2(正方形)の穴状炭素を含む、さまざまな穴サイズのグリッドが試行されました。2/4穴の炭素膜を備えた200メッシュの銅ファインダーグリッドは、長いガラス質のラメラを粉砕するのに適切な厚いセル層を提供します。穴が大きいか小さいかは、一般に、それぞれセル層が薄すぎたり厚すぎたりします(図2A-C)。2/4ホールカーボンでは、グリッドを背面(非カーボン側)から吸い取ることによってシゾントが2μmの穴から引っ張られ、その結果、細胞がカーボン膜の上下に突き出ます。穴の間に4μmのカーボンが伸びると、結果として生じるラメラのほとんどの中央にカーボンのストリップが走り、強度が増します。ファインダーグリッドは相関およびスクリーニングの目的に最適です44が、メッシュ設計の数字/文字が大きすぎないように注意する必要があります。 手動プランジャーでのブロッティング時間は約20秒ですが、ブロッティングを停止する正確なポイントは、グリッドから引き出される液体の液滴がろ紙上に広がるのが止まったときに目で判断されました。ブロッティングプロセスを開始するために、液滴の表面張力を破るために破れたエッジが必要でした。この研究では自動プランジフリーザーは使用されていませんが、このサンプルの合理的な出発点は、手動プランジャーに使用されているのと同じ体積のセルとグリッドタイプを使用し、高湿度(~70%)と周囲温度(~25°C)の条件でグリッドを背面からブロストすることです。ブロッティング時間と条件は、使用する特定の自動化システムに合わせて最適化する必要があります。 熱帯熱マラリア原虫の急落凍結グリッドは、試料が電子に伝達されないため、TEMではなくクライオステージを備えた光学顕微鏡によってスクリーニングされました。より薄いサンプルの場合、サンプルをクライオFIB-SEMに移す前に、TEM(~150倍の倍率で全グリッドアトラス)でグリッドをスクリーニングすることができ、これは国の施設にアクセスするための前提条件となる可能性があります。グリッド全体および個々のグリッド正方形内の氷の厚さの勾配に特別な注意を払う必要があります。適切なグリッド正方形は、1セルの厚さであるか、その中心で炭素膜に当たる必要があります(図2C)。これにより、グリッドスクエアのエッジの周りのグリッドバーに対して厚い氷を粉砕することを回避し、イオンビームがセル層の上下を突破し、くさびではなく自由なラメラを生成します。再現性のあるブロッティングおよびプランジ凍結条件が最適化されると、通常、FIBミリングの前にスクリーニングは不要になります。 図 2.凍結した 熱帯熱マラリア原虫の グリッド上の細胞分布をクライオライト顕微鏡で解析。 (A)クライオライト顕微鏡によるグリッド正方形を横切る氷が厚すぎて、細胞と炭素膜を覆い隠している例。スケールバー、10 μm。 (B)穴のサイズ(5/2四方の穴のある炭素膜を備えた300メッシュの銅グリッド)が細胞に対して大きすぎるため、氷のない空の領域に囲まれた生物学的材料の非常に薄い層が得られる例。このようなグリッドは、非常に短く不安定なラメラを生成します。スケールバー、10 μm。 (C)2/4穴カーボン膜を有する200メッシュ銅グリッド上の良好な細胞分布の例。これらのシゾントをE64阻害剤で処理した。明確に定義された周辺を持つ大きな細胞(赤い箱、直径~5μm)は、まだ無傷の液胞膜を持っている感染した赤血球です。小細胞のクラスター(青いボックス、~1 μm)は、部分的に崩壊した宿主赤血球内に含まれる個々のメロゾイトです。各シゾントの中心には黒い斑点があり、ヘモゾイン結晶の位置を示しています(詳細については 図1 を参照してください)。細胞形態の違いは、クライオFIB-SEM内で一度見るのはそれほど簡単ではありません。したがって、クライオライト顕微鏡による事前スクリーニングは、再現性のあるブロッティング条件に達するまで有益です。グリッドバーの隣のグリッド正方形のエッジの周りのセルカバレッジ(白い破線の領域)は、ミリングするには厚すぎます。グリッドの正方形の中央にある薄い領域(黄色の破線の領域)は、ラメラを細胞の周囲の層に伸ばして、製粉するのに理想的な場所です。スケールバー、6 μm。 (D)12時位置と6時位置に、1つはカットアウェイセクション(黒ブラケット)内、もう1つは反対側の2つの黒いマークが付いたクライオFIB固有のオートグリッドリムの画像。黒い矢印はミリング方向を表します。(E)グリッドをオートローダーカセットにロードする場合、マークはローディングピンセットの両側に等距離にある必要があり、その結果、ラメラはステージの傾斜軸に垂直になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 断層撮影用のクライオFIB固有のオートグリッドリムのマーキング通常、グリッドはフライス加工の前にオートグリッドリムにクリップされ、取り扱いを容易にし、剛性を提供し、後続の転写ステップ中の損傷からラメラを保護します。CryoFIB固有のオートグリッドリムは、フライス加工中により多くのグリッド面にアクセスできるようにカットアウェイ機能を備えて設計されています。TEMのチルト軸に垂直にフライス加工方向を向けて、ラメラをその長さに沿って回転させることでチルト系列取得が進行するようにすることが重要です。これにより、ラメラを囲むトレンチの高い壁が、グリッドが傾いているときに生物学的情報を覆い隠さないことが保証されます。 通常、オートグリッドリムは、クライオFIB-SEMシャトル内および後でTEMをロードするときに視覚的な位置合わせに役立つようにマークされています。これらのサンプルでは、12時位置と6時位置に消えないマーカー( 材料表を参照)で2つのマークが適用され、1つはクリップリングのカットアウェイセクションの中央に、もう1つは真向かいに付けられました(図2D)。TEMにロードするとき( 材料表を参照)、両方のマークがローディングピンセットの両側に表示され、ピンセットの端に対して90°位置合わせされている必要があります(図2E)。イオンビームの近くにある特定のインクがフライス加工を妨げる可能性があるため、製造業者はオートグリッドリムに刻まれたドットを使用してグリッドを整列させることを推奨していることに注意する必要があります。 クリップされたグリッドは、クライオステージ用に変更されたカセットを使用して光学顕微鏡でスクリーニングすることができ、クリッピングプロセスがグリッドの炭素膜を破壊していないことを確認するのに役立ちます。サンプルカセットによっては、クリップされていないグリッドもフライス加工できますが、クライオFIB-SEMからTEMへの転送時には、ラメラが破損するため、グリッドの曲がりを制限するように細心の注意を払う必要があります。クリップされていないグリッドは、サイドエントリークライオホルダーによってTEMにロードできますが、フライス加工後にクリッピングを実行すると、ラメラが破損する可能性が高くなります。 有機白金コーティング有機白金コーティングは、クライオFIB-SEMにロードされた後、一方または両方のグリッド上で実行されます。ガス注入システム(GIS)の針をサンプルの上のチャンバーに挿入して、加熱源からグリッドの表面を横切って有機白金蒸気の流れを一定時間導きます。蒸気は冷たい表面で凝縮し、固体層(~2μmの厚さ)を形成します。このコートの完全性は、均一に薄いラメラを粉砕できるようにするために重要です。有機白金コートの最適な塗布条件は、通常、機器の製造元によって事前に決定されていますが、それでもある程度の最適化が必要になる場合があります。ほとんどのシステムは、チャンバー上のポートの形状とステージの回転限界に応じて、GIS針をフライス加工方向に近づけるか、フライス加工方向に垂直に位置合わせします。グリッドをコーティングし、小さな領域をフライス加工し、ステージを傾け、SEMでコートの厚さを測定することで、さまざまな設定を試すことができます。 クライオFIB-SEM自体のセットアップだけでなく、1)サンプルのトポグラフィー、2)グリッド上の表面汚染、3)GIS針からの蒸気流の再現性など、他の多くの要因が有機白金コートの適用に影響を与える可能性があります。GIS フローは方向性があるため、不均一なトポグラフィーにより、セルの影にある領域や表面汚染がコーティングされていないか、コートが薄くなる可能性があります。これにより、研磨中に有機白金層が崩壊する可能性があります(図3)。粉砕する領域を選択する際には、周囲の地形、例えば、大きな表面汚染、セルの塊、またはグリッドの表面から数グリッドの正方形まで突き出た壊れた炭素は、蒸気の流れを妨げ、より薄い有機白金の影を作り、ラメラを弱める可能性があります。さらに、ラメラの前端近くの表面汚染の非常に小さな粒子も、フライス加工中に飛び出し、裸の氷の弱体化したパッチを残し、研磨中にラメラに穴が開く可能性があるため、避ける必要があります。最後に、フライス加工が始まり、有機白金コートが不安定に見える場合は、もう一度コーティングするか、バックアップグリッドに交換します。 図3:薄く均一に粉砕されたラメラを得るためには、高品質の有機白金コーティングが不可欠です 。 (A)有機白金コーティング(OP、黄色)が薄く塗布されすぎて、研磨中にラメラの前縁に穴が開いたラメラの前縁の穴(緑色の円)とラメラの幅全体にわたる不均一なフライス加工(スジ)につながるラメラの前縁の顕微鏡写真。有機白金の表面はイオンビームによってせん断され、コーティングの前縁の後ろに材料がスプレーされます(黄色の破線)。(B)有機白金コート(OP)をより厚く塗布し、より均一に薄くしたラメラを実現しました。コートの完全性はラメラの全幅にわたって維持され、有機白金コートとガラス化した生物学的材料との間の界面は明確に定義されています(黄色の破線)。カーボン層はラメラ(オレンジ)の後部を通って走っているのを見ることができます。スケールバー、1 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 クライオFIB-SEMにおけるグリッド品質の評価とフライス加工のプロセスグリッドがクライオFIB-SEMに転送されると、炭素膜の完全性およびグリッド上の細胞の分布をSEMによってスクリーニングすることができる(図4A-C)。氷の勾配、グリッドバーの位置、ファインダーグリッド上のグリッド番号の位置は、30 kVの低倍率SEMで確認できますが(図4B)、高倍率でミリング位置を特定し、ミリングプロセスを監視しながら電圧を5 kVに戻して、表面トポグラフィーからのコントラストを高める必要があります。 図4:クライオFIB-SEMでグリッドの品質を評価し、粉砕する領域を特定します 。 (A)SEMを介した5kVでのグリッドの低倍率の概要。オートグリッドリムのカットアウェイセクションは、画像の下部に表示されます。スケールバー、0.5 mm。 (B)SEMによる30 kVでの同じグリッドで、より厚い氷(より暗いグリッドの正方形)とより薄い氷(より薄いグリッドの正方形)の領域を示しています。挿入図はボックス内の領域を示し、矢印は30kVで表示されるファインダーグリッド上の番号付けを示します。スケールバー、0.5 mm。 (C)炭素膜上のセルの分布とグリッドバーの位置を評価する2つのグリッド正方形の中倍率の概要。スケールバー、50 μm。 (D)高倍率での最初のカットのミリングパターンの配置(1.5 pAおよび30 kVでのイオンビームビュー)。赤色の領域(厚さ3μm)は保護され、黄色の領域はイオンビームによってアブレーションされます。白い破線は、最終的なラメラの位置を示します。スケールバー、10 μm。 (E)研磨された厚さ200 nmのラメラ(幅10 μm×長さ15 μm)のSEMを介した3 kVでの高倍率図。3 kVでのラメラ内のコントラストの損失は、適切な厚さに達したことを示しています。明るい白色の前縁は、フライス加工の前にGISを介してグリッドに適用される残りの有機白金層です。スケールバー、5 μm。 (F)30 kVおよび1.5 pAのイオンビームを使用して見た(E)と同じラメラ。黒い四角形を横切る細い白い線(白い矢印)は、ラメラの最前端に残っている有機白金コートです。スケールバー、10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ミリングする領域は、イオンビームビュー(図4D)で保護領域の両側に高倍率(シゾントの場合は~7,000倍)で一対の長方形パターンを配置することによって選択されます。表面汚染の粒子がミリング領域の近くに付着していないことは、保護有機白金コートの適用を覆い隠している可能性があるため、重要です。また、領域の地形が、最終的な厚さが達成された後のラメラの側面をサポートするのに適していることも重要です。 マラリアシゾント(細胞サイズ:直径~5μm×厚さ2μm、円盤状)の場合、幅7〜20μmのラメラを粉砕することができます。細胞層が適度に厚い場合、ラメラは通常、長さが~10-15μmになり、カーボン層の上下に複数の細胞を捕捉します(図4E-F)。8時間のセッションで5〜10個のラメラをフライス加工することが期待できます(6〜7時間のフライス加工と1〜2時間の研磨)。これは、サンプルの厚さとラメラの幅によって異なり、サンプルが厚く、ラメラが広いほど、フライス加工に時間がかかります。損傷したグリッドでも、ラメラのセットを生成するために必要なのはほんの一握りの優れたグリッド正方形であるため、フライス加工できます(図5A)。さらに、サンプルが予想よりも薄い場合、たとえば、培養物のオーバーブロッティングまたはヘマトクリット値の変動により、短いラメラを比較的迅速に粉砕できます。ただし、長さが短いと、TEMでのデータ収集に使用できる領域が制限されます(図5B)。 図5:フライス加工中に最終的なラメラの厚さに達した時期の決定 。 (A)クリッピング中の炭素損傷を示す5kVのSEMによるグリッドの低倍率の概要。損傷していない領域には、オーバーブロッティングのために非常に薄いサンプルが含まれていました。しかし、クライオFIBSEMの終日のセッションで、このグリッド(白い破線の輪郭内の領域)で6つのラメラを粉砕することは依然として可能でした。スケールバー、0.5 mm。 (B)このグリッド(3 kVのSEM)から生成された短いラメラ(幅~10 μmx長さ3 μm、有機白金層を除く)で、チルトシリーズを収集するための2つの領域を提供しました。スケールバー、25 μm。 (C)最終研磨ステップ中のラメラの一連のSEM画像(3 kV)は、ラメラが薄くなる(左から右に移動する)ときにラメラのコントラストがどのように失われるかを示しています。すべての画像のラメラの中央を横切る濃い黒い線は、グリッドからのカーボンフィルムのストリップです。この領域の前の細胞は炭素膜の上をガラス化し、この領域の後ろの細胞は炭素膜の下でガラス化した。ラメラの前縁の左側にある有機白金コートが構造的完全性を失いそうになったときに、フライス加工が停止しました。この停止点は、ラメラ全体が均一な厚さになる前であったため、ラメラの背面にはまだコントラストの高い素材があります。(D)(A)に示すグリッド上に粉砕されたラメラに基づく研磨ルートの一例。研磨ルートは、FIB源に近いラメラから開始し、FIB源から離れて、粉砕された材料のラメラの表面への再堆積を制限する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 研磨中、ラメラの最終的な厚さは、粉砕される領域のサンプルの構造、有機白金コートの完全性、および利用可能な時間に依存します。理想的には、3 kVのSEMによってラメラの表面全体にわたってコントラストが失われるまでサンプルを薄くする必要があり、均一に電子透過性であり、厚さが約150〜200 nmであることを示唆しています(図5C)。ただし、有機白金層に穴が開いたり、ラメラが曲がり始めたりする場合は、この時点より前にフライス加工を停止する必要があります。この場合、ラメラは前面でまだ十分に薄く、断層撮影に有用なままであり得る。逆に、ラメラが安定しているように見える場合は、コントラストの喪失段階を超えて薄くすることができ、ミリングパターンを互いに近づけることによってさらに薄くすることができます(~100nm以下)。これは、下流のワークフローに必要な厚さによって異なります。研磨ルートを計画するには、低倍率のSEM画像が必要であり、イオンビーム源の近くから始めて作業します(図5D)。研磨ルートの方向は、すでに仕上げられたラメラへのアブレーションされた材料の再堆積を防ぐために重要です。 傾斜系列データの収集と処理TEMにロードされると、低倍率のフルグリッドモンタージュ(~150倍)がラメラの位置を特定し、フライス加工の最後に撮影された低倍率のSEM画像と相関させることができます。プランジ凍結シゾントの場合、グリッドのほとんどは電子に対して透明ではないため、ラメラの位置は黒い背景に白いノッチとして表示されます(図6A)。顕微鏡の傾斜軸に対するラメラの角度は、垂直軸から~10°以上離れていると傾斜系列の取得が困難になる可能性があるため、注意が必要です。各ラメラの位置にある中倍率のモンタージュ(~1,500倍)は、生物学的含有量の概要を示し、移動損傷、結晶氷、または過度の表面汚染をチェックします(図6B-D)。これは、表面の汚染が取得領域またはフォーカス領域を覆い隠さないことを確認するために、高傾斜でもチェックする必要があります。取得領域の選択は、生物学的特徴だけでなく、周囲の領域の氷の構造的完全性にも依存します。チルトシリーズを取得する前に、±10°のプレチルトをグリッドに適用して、ラメラの平面(グリッドではない)を光軸に垂直にします。プレチルトの方向は、中倍率のモンタージュにおけるラメラの前縁の位置(残った有機白金コートを探す)によって決定することができる。ここで使用したTEM(300 kVタイタンクリオス)では、ラメラの前端が地図上で上を向いている場合、+10°のプレチルトが必要であり、下を向いている場合、-10°のプレチルトが必要でした。各グリッドは、ピンセットでピックアップしてオートローダーに挿入する方向によって異なる場合があります(カットアウェイセクションが左または右を向いており、180°回転します)。最後の考慮事項はピクセルサイズです。通常、傾斜系列は、関心のある特徴のサイズ、結果として得られる断層撮影データの目標解像度、および取得領域のサイズを制限する可能性のあるラメラの表面積を考慮して、約2.5〜7 Å/ピクセルで収集されます。高解像度の情報を得るためにより小さなピクセルサイズを使用することは可能であり、これらのサンプルで正常に使用された最小は1.4 Å/ピクセルです(データは示されていません)。ドリフトは、より小さなピクセルサイズでより明確になり、解像度の最大化が研究で重要な薄い(<100 nm)ラメラにのみ実際に適しています。 図6:傾斜系列を取得するためのアクセス可能な関心領域の選択 (A)ラメラを含む領域を示す低倍率TEMマップのセクションは、黒い背景(赤い矢印)に6つの白いノッチとして表示されます。白い四角は壊れたカーボンフィルムです。(B)損傷して失透したラメラの中倍率マップ。ラメラ(FE)の前端で、有機白金コートが剥がれています(1)。ラメラの中央に結晶氷の透明なパッチがあります(2)。イオンビームは、グリッドバーの隣の氷が厚すぎるため、ラメラ(BE)の後端で突破できませんでした。ラメラのごく一部だけがBE(3)で周囲の氷から解放され、くさびを作ります。厚さはまた、棚がラメラ(4)の上で切断される原因となり、TEMの高傾斜で細胞の視界を遮る可能性が最も高い。(C)TEMで見たラメラ全体の中倍率モンタージュ。ラメラからチルトシリーズを採取する際に避けるべき典型的な問題または領域は、表面汚染(SC)で覆われている領域、有機白金コートで覆われている領域(OP、黄色)、亀裂の近く(CRおよび黒矢印)、生物学的材料の密度変化によるカーテンがある領域(CUおよび青括弧内の領域)、および有機白金コートの破断によって弱くなった領域(緑色の円)です。傾斜系列集録でアクセス可能な領域は、2つの黒い破線のボックス(ラベル1と2)内の領域のみです。表面の汚染によって関心領域や焦点領域が不明瞭にならないように、高傾斜でビューをチェックする必要があります。(D)はるかにきれいなラメラの中倍率のモンタージュですが、研磨中に有機白金コート(緑色の円)が薄くなるために亀裂(CR)が残っています。ここでは、関心のある領域は、ラメラ内で観察される細胞タイプによって強調表示され、この場合は個々のメロゾイトであり、ラメラの後方に向かって炭素層(オレンジ)の後ろに配置されます(黒い破線のボックス)。スケールバー、3 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図7:FIB粉砕ラメラからのクライオETデータの取得。 (A)最近熱帯熱マラリア原虫に侵入された赤血球を含むラメラの領域の顕微鏡写真。(B)では、同じ画像に、赤血球(赤)、多数の二重壁細胞内小胞(それぞれ内膜と外膜の紫と青)、およびメロゾイト(緑)の宿主細胞に由来する第2の膜(黄色)の境界を示す注釈が付けられています。黒いボックスは、傾斜系列が取得された領域を示します。スケールバー、500 nm。(C)メロゾイトの頂端で取得された8倍のビニング断層像(2.4 Å / pixel)からXY平面で見た平均20の中央スライスと、(D)その注釈で、細胞を囲む2つの膜(緑と黄色)と、電子密度の高いキノコ型の特徴(紫)に関連するメロゾイト(青)の頂点に積み重ねられた4つの膜を示します。赤い矢印は、頂点の膜スタックとキノコの形の特徴の接合部を示しています(パートF、iにも示されています)。黒い矢印は、メロゾイト原形質膜と寄生虫内の多層小胞の1つとの間の融合イベントを示します(パートF、iiにも示されています)。宿主赤血球膜(赤)を示し、黒破線は(E)に示すXZ平面で見た断面の位置を示す。断面(E)のフィーチャは、パーツ(D)と同じように色付けされ、色付きの矢印が膜を指しています。黒色矢印は、粉砕後にラメラに塗布されたスパッタコートの位置およびラメラの厚さを示す。部品(C-E)の場合、スケールバー、500nm。(F)(C)の部分の赤と黒の矢印で示された特徴のより詳細な図、メロゾイトの頂点における膜スタックの脂質二重層における定義(i)および多層小胞とメロゾイト原形質膜との融合イベントを示す。スケールバー、75ナノメートル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 この作業の主な焦点は、メロゾイトの出口の経路を分析することです。 P. falciparum しかし、研究で使用された細胞の集団が完全に均質になることは決してないことを考えると、ラメラ内の細胞発生の他の段階がしばしば観察されました。次に示す例 (図 7)には、最近侵入された赤血球が含まれています P. falciparum 寄生虫(メロゾイト)。使用したラメラの厚さは240 nmで、TEMに挿入する前に、グリッドにアルゴン雰囲気で白金を軽くスパッタコーティングしていたため、通常予想されるよりもわずかにコントラストが低くなりました。赤血球膜は、細胞を取り巻く全体を追跡することができました。赤血球内には、3つの囲まれた膜結合構造、2つの小胞があり、それぞれが二重膜と電球型の特徴(最も広い部分で1.2 μm x 0.9 μm)で囲まれており、メロゾイト(図 7A-B).2つの小胞の内容物は、赤血球の内容物の内容物とは対照的に類似しているようであり、これらの小胞にヘモグロビンが含まれている可能性があることを示唆しています。浸潤後の宿主赤血球内の小胞の存在は以前に観察されている45.それらは、侵入中に宿主の赤血球に放出されるメロゾイトのロプトリーと呼ばれる分泌オルガネラからの脂質および他の病原性因子の分泌から生じると考えられています。メロゾイトは2つの密接に関連する膜に囲まれており、その最も内側はおそらくメロゾイトの天然原形質膜であり、その上に目に見える表面コーティングはなく、最も外側はメロゾイトが侵入するときにメロゾイトを包む宿主赤血球膜に由来する必要があります。メロゾイトの細胞質は、多くの多層小胞と、頂点の膜のスタックに隣接する電子密度の高いキノコ形の特徴を含んでいます。この領域(2.4 Å / pixel)で取得された傾斜系列は、キノコの形の特徴に接続されているように見える4つの膜のスタックが含まれていることを示しています(図 7C-E).驚くべきことに、この形態は、成熟したメロゾイトの頂端における細胞小器官および細胞構造の正常な配置とはかなり異なる。これを評価するために、成熟メロゾイトの頂端にわたる比較チルトシリーズ(2.74 Å / pixel)を、プランジ凍結および粉砕前にE64で処理されたシゾントから取得しました(図 8).これは、メロゾイトの頂端には、細胞の頂端にある3つの極性リングのセット内に囲まれ、ミクロネムと呼ばれる多数の小さな分泌オルガネラに囲まれた、ロプトリーと呼ばれる2つの顕著なクラブ状の分泌オルガネラが含まれていることを示しています。最も内側の極性リングは、侵入を促進するモータータンパク質を含む内膜複合体と呼ばれるメロゾイト原形質膜の下にある二重膜構造に付着しています。浸潤中に、分泌オルガネラの内容物がメロゾイト表面および宿主赤血球に排出され、メロゾイトの宿主赤血球への付着を促進し、侵入を促進するモーター複合体を開始することが示されている45.ここのデータは、侵入後、メロゾイトには、菱形、ミクロネム、または極環に似た観察可能な構造が含まれていないことを示しており、メロゾイトの頂端の形態が劇的に変化することを示唆しています。侵入前のロプトリーの融合は、固定された室温切片のTEMによって以前に示されています46これは、侵略後の状態のメロゾイトで観察されるキノコの形の特徴の生成と一致しています。この特徴に関連する膜のスタックはこれまで観察されておらず、新たに侵入したメロゾイトにIMCが存在する兆候がないため、膜スタックは侵入が完了した後に残ったIMC機械の残骸である可能性があると仮定しますが、これはまだ確認されていません。 図8:FIB粉砕ラメラのクライオETによる成熟メロゾイトの頂端とプラスチック切片のTEM。 (A)成熟メロゾイトの頂端の典型的な形態を示す厚さ230 nmのラメラからの8倍ビニング断層図(2.74 Å /ピクセル)からの平均20の中央スライス。シゾントはプランジ凍結前にE64で処理されたため、PV膜が破裂し、メロゾイトが宿主赤血球内に含まれています。(B)は(A)と同じことを示すが、宿主赤血球膜(RCM、赤)、メロゾイト原形質膜(緑)、内膜複合体(IMC、紫)、極性リング(PR、黒)、ミクロネーム(M、黄色)、ホップトリー(R、灰色)、および核膜(NE、青)を示す注釈が付いている。断層撮影のこの領域で平面外にある隣接するメロゾイトは、緑色の三角形で示されます。スケールバー、200 nm。(C)クライオETによって観察された細胞の特徴は、プラスチック切片に保存されたシゾントのTEMからのものと一致しています。同様の細胞の特徴は、化合物2で処理されたシゾントからの成熟メロゾイトで示され、PV膜破裂の前に出口を停止します。スケールバー、500 nm。(D)部分(A-C)の細胞の特徴を示すメロゾイトの注釈付き概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 長方形のミリングパターン間の保護領域の厚さ(μm) 30 kV での公称イオンビーム電流 (pA) 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 (最終研磨) 30* 表1:薄いラメラを製造するための製粉戦略。 段階的粉砕は、保護領域の厚さに対応するイオンビーム電流を減少させることによって行われる。これにより、サンプルの加熱が制限され、失透が防止されます。*研磨は、ラメラに両側から均等に熱を加えるために並行して実行する必要があり、最終的な厚さに達したときにラメラが曲がったり曲がったりするリスクを減らします。他のステップは、次のビーム電流に移動する前に、ラメラの上、次にラメラの下のパターンをフライス加工して、順番に実行できます。フライス盤位置を特定するためのグリッドの調査は、サンプルの加熱を最小限に抑えるために、1.5pAのビーム電流で実行する必要があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。