장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법
Summary
여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.
Abstract
창자 상피의 안대기는 루멘에 그들의 정압측을 드러내고 외부 단서에 반응하는 전문화한 상피 세포의 간단한 층으로 이루어져 있습니다. 최근 시험관 내 배양 조건의 최적화를 통해 장줄기 세포 틈새 시장을 재창조하고 세포 조성 및 상피의 조직을 재구성하는 고급 3차원(3D) 배양 시스템의 개발을 가능하게 한다. 세포외 매트릭스(ECM)에 내장된 장 내 오르가노이드는 내부 루멘과 외부 노출 기저 측을 포괄하는 잘 정의된 편광 상피를 생성하기 위해 장기적이고 자가 구성을 위해 유지될 수 있다. 장 기관지의 이 제한적인 본질은 시험관내 상피의 정량표면에 접근하는 데 어려움을 제시하고 영양 섭취 및 숙주 미생물/숙주 병원균 상호 작용과 같은 생물학적 메커니즘의 조사를 제한합니다. 여기서, 우리는 오르가노이드 상피의 정압 측에 대한 접근을 용이하게 하고 특정 장 세포 유형의 분화를 지원하는 두 가지 방법을 설명합니다. 첫째, 우리는 ECM 제거가 상피 세포 극성의 반전을 유도하고 정계 아웃 3D 오르가노이드의 생성을 허용하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 성숙하고 분화된 세포 유형으로 구성된 장 가구형으로부터 유래된 단일 세포 현탁액으로부터 2차원(2D) 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 시험관 내 외부 큐와 상피의 정표 특정 상호 작용을 연구하고 정밀 의학을 용이하게하는 플랫폼으로 오르가노이드의 사용을 촉진하는 새로운 도구를 제공합니다.
Introduction
장 상피는 인체에서 두 번째로 큰 상피이며 영양 섭취를 용이하게하고 환경 모욕 에 대한 장벽 역할을하는 편광 세포 층으로 구성됩니다1. 정문과 바소측 사이의 이러한 구별은 상피의 세포가 다양한 기능을 수행 할 수 있습니다. 정포 구획은 루멘에 노출되어 환경 자극 및 미생물과의 상피 상호 작용을 중재하는 동시에 영양 섭취를 촉진합니다. 바소쪽 표면은 세포 간 접합및 세포 매트릭스 접착력을 수용하고 면역 계통 및 기타 조직의 세포와 상호 작용하는 동안2. 이러한 접합은 장벽 역할을하고 주변 신체 조직에 흡수 된 영양소를 전달하는 지하 막에 부착 된 불투과성 단층을 생성합니다.
시험관 내 이러한 장 기능을 재구성할 수 있는 문화 시스템의 구축은도전적이다 3. 기존의 체외 모델은 Caco-2와 같은 변형된 인간 대장암 세포주를 활용하여 2D 단층 배양을 생성합니다. 흡수 구획의 여러 기능을 모델링 할 수 있음에도 불구하고,이 모델은 완전히 주요 기능적 특성과 응용 프로그램을 제한장 상피 조성 및 기능을 재구성 할 수 없습니다4,5.
장기 특이적 세포 유형으로 자가 구성및 분화할 수 있는 줄기 세포로부터 생성된 고급 3D 배양 시스템으로 오르가노이드의 출현은 장 상피6의시험관 내 연구에서 돌파구였다. 장 내 오르가노이드는 기저 라미나와 유사한 세포외 매트릭스(ECM)에 내장되어 있으며, 이러한 배양이 상피의 양피상극을 유지할 수 있도록 세포 매트릭스 접합을 형성한다. 오르가노이드는 유정측이 발광 구획에 노출되어 장의 구조를 모방하는 밀폐된 아키텍처를 나타낸다. 이 폐쇄된 조직은 방향별 기능을 연구할 수 있는 기회를 제공하지만 상피의 정점에 대한 액세스가 필요한 조사를 제한합니다. 오르가노이드 단편화, 오르가노이드 미세 주입 및 단일층 배양7의생성을 포함하여 2D 및 3D 모두에서 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 접근 법이 취해졌습니다. 오르가노이드 단편화는 구조 조직의 손실과 세포 접합의 파괴를 일으켜 상피 표면의 상피 표면을 매체에 노출할 수 있게 한다. 이 기술은 세포외 매트릭스로 시드될 때 오르가노이드를 개혁하기 위해 조각의 재생 능력을 활용하고 감염성 질환 및 숙주 병원체 상호 작용을 모델링하는 데 사용되었습니다8,9. 그러나, 정압 및 기저 표면에 대한 동시 접근은 또한 감염에 대한 비특이적 반응을 유도할 수 있다.
정표면에 접근할 수 있고 구조 구조 구조와 세포 접합을 모두 보존하는 대안접근법은 오르가노이드의 루멘으로 요인을 미세 주입하여 표현된다. 이 방법은 호스트 병원체 상호 작용을 연구하고 Cryptosporidium10, H. 파일로리11및 C. difficile12의 효과를 시험관 내의 위장 상피에 모델링하는 데 광범위하게 활용되었습니다. 유사한 기술을 사용하여, 장 상피에 대장균의 pks+ 균주의 돌연변이 전위가13을결정하였다. 비록 효과적인, organoid micro주입은 측정 가능한 효과 얻기 위해 주입 하는 데 필요한 장기의 높은 수를 고려 하는 힘들 고 비효율적인 작업 따라서 높은 처리량 측정량 에 대 한 그것의 응용 프로그램을 제한.
장 가구형과의 최근 발전은 또한 2D 단층 오르가노이드 배양의 확립을 위한 방법을 제공하여 그들의 apical 표면14,15,16,17을노출한다. 이러한 오르가노이드 유래 단층은 장 상피의 생체 내 특성에서 키를 재구성한다. 그(것)들은 분화하고 줄기 세포 인구를 둘 다 포함하는 생리적으로 관련있는 세포 조성물을 전시하고 crypt-villus 축을 통해 다양성을 모델링합니다. apicobasal 극성이 유지됨에 따라 고유의 단층 특성을 통해 정문 및 바식자 측 과 미디어 교환을 쉽게 접근할 수 있어 장 내 흐름과 폐기물 제거를 모방하여 장기적인 문화를 가능하게 합니다. 이러한 특징은 오르막성 단층원으로 발광 상호 작용에 초점을 맞춘 연구를 가능하게 하고 상피 장벽 무결성 및 투과성18,19에대한 우수한 모델을 제공한다.
연구에 따르면 상피 세포 극성은 MDCK 스페로이드20,21의 ECM 단백질에 의해 엄격하게 조절되고 있으며 최근에는 인간 장 가구(22)에서 과같이 조절된다. 세포 매트릭스 접합을 중재하는 인테그린 수용체의 ECM 성분 또는 억제의 제거는 장 장기성의 극성 반전과 상피 측의 노출을배지(22)에초래한다. 이 접근법은 3D의 정압 측에 쉽게 접근할 수 있고 높은 처리량 분석에 가능하게 하기 때문에 전염병에 일하는 연구원의 관심을 끌었습니다. 여기서, 우리는 쉽게 그들의 apical 측을 드러내는 3D 장 기관지성의 생성을 용이하게 하는 Amieva 실험실22에의하여 최근 작동을 기반으로 수정된 프로토콜을 기술합니다. 또한 장 내 오르가노이드에서 파생된 장 2D 단층층을 효율적이고 재현가능하게 생성할 수 있는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상피 오르가노이드 모델은 조직 조직, 질병 진행을 모델링하고 치료 치료23,28,29를식별하는 데 사용할 수있는 강력한 플랫폼이되었다. 오르간구이성 미생물분사술은 숙주 상피의 정량면과의 병원균 상호작용을 허용하기 때문에 감염성 질환을 모델링하는 오르가노이드의 능력에 가치를 더합니다. 최근 미세 주입 기술의 발전은 오르가노이드의 주입 속도를 최적화하고 시간당 최대 90개의 주입 된 오르가노이드의 속도를 달성했습니다. 주입된 오르가노이드의 장벽 기능이 보존되었고, 루멘 내부의 낮은 산소 농도는 의무적 혐기성주입균(30)의생존을 허용했다. 그러나, 연구는 같은 잘 내에서 장기 체이 질 인구의 존재 지적. 이러한 차이는 키 유전자(32)의 크기 및형상(31)및 발현 수준뿐만 아니라 증식율(33)에서 관찰되었다. 산림 및 PGE2 와 같은 화합물에 동일한 오르가노이드 집단 내의 차동 반응, 또는 콜레라 독소에, 또한28,33을기술되었다. 이러한 결과 연구에서 높은 오르가노이드 숫자에 대 한 필요성을 강조 하 고 발광 주사의 활용을 제한.
종래의 오르가노이드 배양은 하이드로겔에서 오르가노이드의 캡슐화 및 전파를 기반으로 한다. 그러나, 하이드로겔은 확산에 한계를 제기하고 농도 그라데이션을 도입할 수 있으며, 이는 이질성을 증가시킬 수있다(34). 더욱이, 높은 가변성은 문화와 기증자 사이뿐만 아니라 개별적인 실험 조건 내에서 문서화되었습니다. 기증원, 하이드로겔의 생화학적 특성 및 배양 시스템으로서 오르가노이드의 본질적인 이질성은 실험적 가변성을 높이고 다운스트림 응용 분야에서 얻은 결과의 재현성을 제한할 수 있는 중요한 요소입니다. 여기에 기재된 두 가지 방법 모두 상피의 정압면을 노출시키는 간단한 수단을 제공하여 배양 배지에 직접 첨가하여 관심 있는 화합물 및 병원균의 모델링을 가능하게 한다. 하이드로겔 사용률이 감소하면 기술적 오류 원인으로부터 의 실험적 변동성을 제한할 수 있습니다.
장 내 장기형은 오르가노이드 모델 시스템의 주요 특성을 유지하고 확장성은 2D 단층과 비교하여 높은 처리량 분석에 더 적합합니다. 그러나, 오르가노이드가 3D 구조를 유지함에 따라, 기저측의 접근성이 제한되고 동시에 양측에 접근해야 하는 연구를 방해할 수 있다.
우리는 장 가구형의 극성 반전이 ECM의 효율적이고 절대적인 제거에 의존한다는 것을 보여주었으며, 또한 오르가노이드의 손상되지 않은 구조를 보존합니다. 특히 하류 애플리케이션을 위해 생산된 아포셜 아웃 오르노이드의 수와 관련하여, 특히 Co, J. Y. 및동료(22)가발행한 프로토콜의 전반적인 효율성을 개량시키는 데 기여한 플라스틱웨어에 대한 오르가노이드 부착을 방지하기 위한 분리 솔루션과 반부착 용액의 사용.
또한, 당사의 프로토콜은 250 μm 보다 작은 오르가노이드의 보다 효율적인 반전을 지원하고 더 큰 오르가노이드를 사용하면 파이펫팅으로 인한 단편화로 인해 오르가노이드 출력이 감소될 수 있음을 관찰했습니다. 재료 의 표에표시된 것과 같은 넓은 보어 팁은 더 큰 오르가노이드의 활용을 허용할 수 있습니다. 그러나, 넓은 보어 팁은 낮은 적용 된 기계적 힘으로 인해 표준 팁에 비해 ECM 해리에 덜 효과적이다. 따라서, 반복 단계 1.2.9-1.2.11은 더 큰 오르가노이드로 작업할 때 충분한 중단 및 모든 ECM 잔재의 완전한 제거를 위해 필요할 수 있다.
서스펜션의 오르가노이드는 적어도 2 주 동안 살아남을 수 있습니다. 이 기간 이후에, 우리는 형태 변경 및 세포 죽음의 증가한 수를 관찰했습니다. 정포 아웃오르가노이드(22)에서 증식 세포의 존재는 장 내 장기성 배양의 재확립을 가능하게 한다. 이는 단일 세포에 정편 아웃 오르가노이드를 분리하고 장 오르가노이드 확장 매체로 ECM에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
현탁액 배양에서 장 오르가노이드의 확립을 설명하는 프로토콜에서 자주 발생하는 제한은 큰 골재의 생성입니다. 이는 형태학적 특징의 효율성, 재현성, 화합물에 대한 투과성 및 파라크린 신호와 같은 여러 변수에 영향을 미칩니다. Co, J. Y. 및 동료가 발표 한 프로토콜과 유사하게 3 일 후에 전단없이 모든 일시 중단 된 오르가노이드의 최소 97 %의 극성 반전을 얻었습니다. 그러나, 출판과는 달리, 우리는 큰 골재의 형성을 줄이고 수율을 높이기 위해 기계적 해리 단계를 도입했다. 이 절차는 오르가노이드의 상피를 손상시킬 수 있기 때문에, 우리는 완전한 상피 회복을 허용하고 다운스트림 응용 프로그램에 대한 고품질의 문화를 보장하기 위해 추가 2 일 동안 오르가노이드 인큐베이션 기간을 연장했습니다. 인큐베이터 셰이커 또는 스피너 플라스크를 사용하여 지속적인 동요가 도입되면 융합 이벤트가 잠재적으로 감소하고 단편화를 최소화하며 산소화를 증가시킬 수 있습니다. 이러한 대체 접근법은 더 긴 기간 동안 배양을 유지하고, 세포 사멸을 감소시키고, 장 가구형의 추가 분화를 허용할 수 있다.
오르가노이드 유래 2D 단층의 설립은 반전된 극성 오르간노이드에 비해 몇 가지 장점과 단점을 제공한다. 여기서 설명된 프로토콜은 일반적으로 7일 이내에 수렴된 단층 배양을 신속하게 확립하고 장기간(최대 10주)에 대한 문화의 장기 유지 옵션을 허용한다. 여기서 사용되는 프로토콜과 매체는 또한 다른 오르가노이드 유래 단층배양(16)에서항상 발견되는 것은 아니라 상당수의 세포의 효율적인 분화를 허용한다. 세포 배양 인서식 막에 단층층을 설치하면 상피의 정모 및 혈관 측모두에 동시에 접근할 수 있어 장벽 무결성 및 상피 운송 연구에 이상적입니다. 이 단순화된 접근은 또한 그(것)들을 감염과 약 처리 연구 결과에 더 순종하게 만듭니다. 더욱이, 이 문화는 기증자에게 유일하게 많은 특성을 유지, 환자 특정 연구에 대한 그들의 관련성을 유지. 또한 ALI 배양 방법은 분비및 흡수세포 유형으로 구성된 보다 기능적인 상피의 분화를 용이하게 하여 인간 장 상피를 보다 대표한다. 이러한 문화의 상대적 안정성은 또한 장기 연구를위한 가능성을 제공, 오랜 기간 동안 유지 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 접근법의 한계는 컨플루천 단층층을 확립하는 데 필요한 세포수가 많고, 완전한 결합을 유지하여 정맥과 바소포챔버 사이의 기능적 분리를 가질 필요가 있다. 3D 오르간구배에서 모델링할 수 있는 특징적인 토굴 아키텍처도 단층 문화를 확립할 때 손실됩니다. 그럼에도 불구하고, 문화의 실험 친화적 인 형식과 상피의 정모및 바소포측에 액세스 할 수있는 용이성, 그것은 장 생리학의 연구를위한 강력한 도구입니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 호라이즌 2020 보조금 OrganoVIR 812673 바이러스 연구를위한 프로젝트 오르가노이드에 의해 지원되었다 – 혁신적인 교육 – ITN 프로그램.
Materials
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
| Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
| Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
| Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
| Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
| Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
| IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
| Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |
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