使用肠道器官模型研究猿特异性相互作用的文化方法
Summary
在这里，我们提出了两个协议，允许肠道特定的相互作用建模。器官衍生肠道单层和空气-液体接口（ALI）培养物有助于产生从亮面和玄武岩两侧获得分化良好的表皮，而极性倒置肠道器官暴露其腹腔侧，并适合高通量检测。
Abstract
肠道上皮的衬里由一层简单的专门上皮细胞组成，这些细胞将它们的上皮侧暴露在流明上，并响应外部线索。最近体外培养条件的优化使得肠道干细胞的再创造和先进的三维（3D）培养系统的发展，可以重新概括细胞的组成和上皮的组织。嵌入细胞外基质 （ECM） 中的肠道器官可以长期和自我组织地维持，以产生一个定义明确、极化的上皮，包括内部流明和外部暴露的基底侧。肠道器官的这种限制性在体外获取上皮表面方面提出了挑战，并限制了对营养吸收和宿主-微生物群/宿主-病原体相互作用等生物机制的研究。在这里，我们描述了两种方法，方便访问器官上皮的 apal 侧，并支持特定肠道细胞类型的差异化。首先，我们展示了ECM去除如何诱导上皮细胞极性的倒置，并允许产生apical出3D器官。其次，我们描述如何从肠道器官衍生的单细胞悬架中生成2维（2D）单层，由成熟和差异化的细胞类型组成。这些技术提供了新的工具，研究上皮与体外外部线索的特定作用，并促进使用器官作为平台，以促进精密医学。
Introduction
肠道上皮是人体第二大上皮，由极化细胞层组成，有利于营养吸收，并作为防止环境侮辱的屏障。这种对上皮和玄武岩侧的区分使上皮细胞能够执行其不同的功能。尖层隔间暴露在流明中，并调解上皮与环境刺激和微生物的相互作用，同时促进营养吸收。玄武岩表面容纳细胞间结和细胞基质粘合，同时与免疫系统细胞和其他组织2进行交错。这些交汇点产生一个不透水的单层连接到地下室膜，作为屏障，并将吸收的营养物质输送到周围的身体组织。
建立能够在体外重新概括这些肠道功能的文化系统一直具有挑战性。传统的体外模型利用转化的人类结肠直肠癌细胞系，如Caco-2，产生2D单层培养物。尽管能够建模的吸收室的多种功能，这些模型不能完全回顾肠道上皮的组成和功能，这限制了关键功能特征和应用4，5。
器官作为一种先进的3D培养系统，由干细胞产生，可以自我组织，并区分为器官特异性细胞类型，是肠道上皮6体外研究的突破。肠道器官嵌入细胞外基质（ECM），类似于基底拉米纳，形成细胞基质结点，使这些培养物能够保持上皮的皮细胞极性。器官展示一个封闭的结构，其中腹侧暴露在发光隔间，从而模仿肠道的结构。虽然这个封闭的组织提供了研究特定方向功能的机会，但它限制了需要访问上皮尖面的调查。采取了不同的方法来克服2D和3D的这些限制，包括器官分裂，器官微射，和单层培养物的产生7。器官碎片导致结构组织的损失和细胞结的破坏，这使得上皮的腹膜表面暴露在介质中。这项技术利用片段的再生能力，在播种到细胞外基质中时对器官进行改造，并用于模拟传染病和宿主-病原体相互作用8、9。然而，同时进入尖顶表面和基底表面也可能引起对感染的非特定反应。
一种允许进入表面并同时保存结构结构和细胞结的替代方法，以微射因子进入器官的流明为代表。该方法已被广泛用于研究宿主-病原体相互作用，并模拟隐孢子虫10、H.皮洛里11和C.难治12对体外胃肠道上皮的影响。采用类似技术，确定肠道上皮上大肠杆菌pks+菌株的诱变潜力13.虽然有效，但器官微注射是一项费力和低效的任务，因为需要注射大量的器官才能获得可测量的效果，因此限制了其高吞吐量检测的应用。
肠道器官的最新进展也为建立2D单层器官培养提供了方法，从而暴露了肠道器官表面14、15、16、17。这些器官衍生的单层重新概括肠道上皮的活体特性的关键。它们表现出生理上相关的细胞组成，包含分化和干细胞群，并模拟整个密码-维卢斯轴的多样性。由于脊柱两极性被保留，固有的单层特性允许容易访问腹腔和玄武岩两侧，媒体交流可以模拟肠道流动和废物清除，从而允许长期培养。这些功能使器官衍生的单层适合研究专注于光相互作用，并提供了上皮屏障完整性和渗透性的优越模型18，19。
研究表明，上皮细胞极性是由心电图蛋白在MDCK球体20，21和最近人类肠道器官22严格调节。去除ECM成分或抑制介解细胞基质结的集成蛋白受体会导致肠道器官的极性逆转，并将上皮的腹腔侧暴露到中等22。这种方法吸引了从事传染病研究的研究人员的兴趣，因为它允许在3D中轻松进入尖峰一侧，并使其能够接受高吞吐量的检测。在这里，我们描述了一个修改的协议的基础上，阿米耶娃实验室22最近的工作，促进3D肠道器官的产生，很容易暴露其尖顶的一面。我们还概述了一个协议，可以高效和可重复地产生肠道2D单层从肠道器官衍生。
Protocol
人类肠道器官培养的衍生在其他地方进行了23日。肠道器官扩张介质（指 材料表）的产品信息表（PIS）所述，在培养物中保持器官。 1. 肠道器官极性的倒置 注：本节将概述逆转3D肠道器官极性的方案。本协议为在培养板中悬浮有暴露表面的极化器官提供了详细的程序。本协议旨在作为终点检测，虽然器官可以保持这种构象超过2周，并保持少量干细胞种群，使他们能够在通过时重新建立体细胞。 涂层文化器皿和管与抗粘附解决方案注：为了最大限度地增加肠道器官的数量，防止不良依附于文化器皿，一般需要预涂文化器皿。下面概述的部分描述了文化和塑料器皿的涂层与抗粘附溶液。 大衣培养板将用于协议的悬挂部分如下。 在 24 井组织培养板的每口井中加入 0.5 mL 的抗粘附溶液。 旋转板，将溶液均匀地铺在井面和墙壁上。 将盘子离心 1，300 x g，10 分钟。 使用吸气器或 1 mL 移液器从每口井中取出防粘附液。 用 1 mL DMEM/F-12 用 15m HEPES （DMEM/F12） 清洗油井。 用 0.5 mL 的 DMEM/F-12 将每个洗好，并将盘子存放在 37 °C 和 5% CO2 处，直到使用。注：如果不立即使用，涂层板可在孵化器中保存至少1周。 此协议中使用的涂层 15 mL 圆锥管如下。 在 15 mL 圆锥管中加入 4 mL 的抗粘附溶液。 旋转管子，使溶液均匀地铺在墙壁表面。 以 1，300 x g 离心管 10 分钟。 从管子中取出防粘附液。 用 5 mL DMEM/F-12 清洗管 1x，并吸气 DMEM/F-12。管子现在已准备就绪，可以使用。注意：如果不立即使用，请添加 5 毫升 DMEM/F12，并存储在 4 °C 下。 涂层管可在 4 °C 下保存至少一周。 悬浮培养物对肠道器官的极性逆转注：下面的步骤概述了以前在标准 ECM 圆顶条件下培养的肠道器官的倒置。这里描述的程序是24井板的一口井。如果使用其他文化软件，请相应地调整体积。 小心地从每个含有器官的井中取出和丢弃介质，而不会破坏地下室膜细胞外基质圆顶。在开始反转协议之前，确保器官的大小为 150-250 μm 直径（通常在第 3-5 天）。 在每个井中加入1mL的冰冷分离溶液。 在室温下（15-25 °C）孵育1分钟。 在 15 mL 管中加入至少 2 mL 的防粘附溶液，用于涂层塑料尖端。 在 15 mL 管中加入至少 2 mL 的 DMEM/F-12，用于清洗用防粘附液冲洗的塑料尖端。 用防粘附溶液涂抹 1 mL 移液器尖端，从第 1.2.4 步开始，用防粘附液将 1 mL 溶液三次吹入管中。 用冷的 DMEM/F-12 清洗尖端，从第 1.2.5 步开始，用 DMEM/F-12 将 1 mL 溶液管道三次注入管中。 使用涂层尖端，小心地通过缓慢的管道移出圆顶。小心不要破坏或分裂器官。 将器官悬浮转移到用抗粘附溶液处理的板（从步骤 1.1.1 开始）。 将盘子放在4°C的摇床上30分钟。陀螺摇床可在晚上 70 rpm 使用。注意：避免剧烈摇晃，例如使样品变形，因为它可能导致器官碎片。气泡和泡沫的形成可能表示剧烈的震动。 30 分钟后，取出盘子。使用涂有防粘液的 1 mL 移液器尖端，轻轻上下移液器溶液。 将盘子放在 4 °C 的摇床上 15 分钟。陀螺摇床可在晚上 70 rpm 使用。 取出板，让器官通过重力沉淀（室温下1-2分钟）。在显微镜下观察板块，以验证有机物沉积。注意：避免板的广泛搅拌，因为它可能导致固定的器官重新悬念。 器官沉降后，取出尽可能多的分离溶液，并加入1.5mL的DMEM/F-12进行洗涤。 让器官沉积，并删除尽可能多的超高超。再次重复洗涤步骤。注：在进行任何洗涤步骤之前，在显微镜下观察板，以验证有机物沉降。 尽可能多地去除DMEM/F-12，并加入0.5mL的肠道器官扩张介质。在 37 °C 和 5% CO2下孵育。 第二天，通过在 25 到 30 度的角度倾斜板，并沿井壁移除介质，进行部分介质变化。去除 0.4 mL 的中等，注意不要去除悬浮器官。 添加 0.4 mL 肠道器官扩张介质。在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 3 天。注：3天后，大多数器官应该具有极性，但大聚合体可能已经形成。 如果聚合器已经形成，请使用 1 mL 移液器，其尖端涂有防粘附溶液（如步骤 1.2.6 和 1.2.7 中所述），通过上下管道上下 20 次剪切聚合物，同时将尖端末端压入板底。 将板置于 37 °C 和 5% CO2 中，第二天用肠道器官膨胀介质（如第 1.2.17 节所述）执行完整的介质变化。 2天后（暂停第5天），肠道器官可用于下游检测。 2. 建立来自3D肠道器官的肠道细胞2D单层和空气-液体接口（ALI）培养物 注：本节将概述从肠道器官生成2D单层培养物的协议。该技术具有在含有细胞培养膜插入的组织培养板中具有暴露表面的汇流、极化单层培养物的优点。虽然单层将开始在淹没的单层格式中进行区分，但单层在达到汇合后切换到 ALI 文化可以实现额外的差异化。单层和随后的 ALI 协议都旨在作为终点检测，尽管单层培养物保持少量干细胞群，但两者都不能在建立后有效分裂和传递。 为肠道单层培养物准备介质和板 准备肠道器官分化介质，由制造商概述的单层培养（见 材料清单）。仅将 Y-27632 添加到介质体积中，该介质将在 1 周内以 10 μM 的最终浓度使用。如果不立即使用，则存放在 4 °C 下。 预热特林埃达 （0.05%） 至 37 °C。 在播种单层培养物之前至少 2 小时，准备 2% 的 ECM 涂层解决方案如下。 在冰上解冻 ECM，在冷、无菌 PBS 中加入 1：50，以准备 2% 的解决方案。准备足够的数量，以添加100微升到上井每6.5毫米（0.33厘米2）细胞培养膜插入使用。针对较大或较小的文化适当调整音量。 在每口井中加入 100 μL，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育每个板材，直到需要（播种前至少 2 小时）。 分离肠道器官，用于单层生成和文化 从孵化器中取出适当数量的器官培养井。参考 表1， 以获得各种文化用品的推荐井数。 从器官文化中吸气所有媒介，而不会干扰 ECM 圆顶。 在每个井中加入 1 mL 的分离溶液。 在室温下（15-25 °C）孵育至少1分钟。 使用 1 mL 移液器，大力上下移液器来破坏圆顶并释放器官。 将每口井的悬浮器官池在 15 mL 圆锥管中。在室温下孵育10分钟，轻轻搅拌或摇晃。在此步骤中，可将用于播种多口井的有机物集中起来，每个管子的体积可达 10 mL。 离心机在 200 x g 5 分钟在 4 °C. 取出并丢弃超高超。添加 5 mL 冰冷 DMEM/F-12 以重新悬浮器官。 在 4 °C 下以 200 x g 再次混合和离心机 5 分钟。 吸气超纳特，尽可能多地去除，小心不要打扰颗粒。注：一些残留的ECM可能留在颗粒中：然而，这不应该显著影响器官的分离。 加入1 mL预热（37°C）特普辛-EDTA（0.05%）以重新使用器官。彻底混合，以确保均匀悬挂。如果大量细胞或大量 ECM 仍然存在，则加起来将额外 1 mL 的 Trypsin-EDTA 用于大量细胞。 在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。 与 1 mL 移液器彻底混合，以尽可能破坏器官。器官应完全分离成单个细胞或小片段。如果较大的片段或整个器官在彻底管道后仍然存在，请在 37 °C 下继续与 Trypsin-EDTA 一起孵育 3-5 分钟。注意：不要与Trypsin-EDTA孵育超过20分钟，因为这可能会导致细胞生存能力的增加损失。 一旦器官被充分分离，添加等量的DMEM/F-12（例如，1 mL DMEM/F-12每mL Trypsin-EDTA）和移液器上下混合彻底。在此步骤中向 DMEM/F-12 添加 10% FBS，从而激活 Trypsin-EDTA。 离心机碎片在 200 x g 5 分钟在 2-8 °C. 如果分离的器官不能颗粒，这是常见的，可能是由于分离细胞释放的粘液积累。在这种情况下，通过上下管道彻底混合细胞，并在 200 x g 下再次离心，在 2-8 °C 下 5 分钟。 小心地去除尽可能多的超高超，只留下细胞颗粒。 将细胞重新用 100 μL 的肠道器官分化介质（10 μM Y-27632）中重新播种，以供每口井播种。适当调整体积以适应更大或更小的井大小。 从孵化器中取出涂层板（以第 3.1.4 步准备），并从每口井中取出多余的 ECM。 将 100 μL 的细胞悬浮件添加到每个细胞培养插入的上井。 将500微升肠道器官分化介质添加到每个细胞培养插入物的下井。 在 37 °C 和 5% 二氧化碳下孵育。 每 2 到 3 天更换一次上下井中的介质。单层文化应在 7 天内达到汇流，并且通常在 2-3 天内达到汇流。 建立空气-液体接口 （ALI） 文化注：如果需要，可以通过将水下单层文化过渡到 ALI 文化来实现淹没肠道单层文化的进一步区分。这种培养方法将允许增加分化细胞类型的数量，特别是分泌血统的细胞，如血小球和肠内分泌细胞。 在单元格培养物插入中建立单层培养物，如上文所述，步骤 2.2.1-2.2.23 并将此培养物保持在 100% 汇流至少 4 天。 要建立 ALI 培养物，请从上下井中取出介质。在下井中加入新鲜的肠道器官分化介质（Y-27632），使上井空无一人。 在 37 °C 和 5% CO2下孵育。 每 2-3 天更换一次下井中的介质，使单层至少分化 1 周。 如果需要，用无菌 PBS 冲洗上井，以去除多余的粘液积累。在这种情况下，ALI 文化可以保持至少 2-3 周。
Representative Results
器官是根据先前描述的23 号协议和肠道器官扩张介质的PIS（见 材料表）的活检样本产生的。 图1A，左面板，显示肠道器官的表型培养在圆顶与肠道器官扩张介质。在这些培养条件下，器官表现出一种囊性形态，由一个薄（10-25μm）的上皮定义，它包围着一个流明（图1A，右面板）。在这个阶段，肠道上皮的尖顶侧面向流明，而玄武岩侧接触周围的细胞外基质。当大多数器官达到所需的大小时，细胞外基质被移除，然后器官在悬浮中培养。细胞结合到细胞外基质的丧失触发了器官的倒置过程，导致器官上皮的极性逆转，使上皮的上皮侧暴露在生长介质中，并将玄武岩侧内化。 在某些文化中，悬浮聚合和引信中的器官，在前3天（图1B，左面板）中效果更为深刻。采用剪切技术，可以分离器官，并以最少的重新聚合方式延续文化数天（图1B，右面板）。 在ECM圆顶中培养的肠道器官继续扩大（图1C，左面板），并表现出自发形成的次生萌芽结构，类似于小墓穴，在流明周围的上皮的玄武岩侧（图1C，右面板）。同时，在没有细胞外基质的情况下维持了5天的器官继续在悬浮中发展（图1D，左面板）。极性的倒置的特点是围绕器官核心的上皮变厚（30-40μm），并出现各种形态：拉长（图1D、右面板 和 辅助图1A）、囊性（辅助 图1B）和不规则（辅助 图1C）。这通常与器官内的发光空间缩小相结合，影响其整体大小。 通过分析肠道特异性极性标记的表达，也可以确认有效的反转。如4+，6-二苯丙酮（DAPI）信号所示，肠道外器官向器官的流明方向呈现出明显的细胞核定位。在暴露在介质的上皮外侧检测到上皮标记的表达，如 VILLIN（图 2A）和 ZO-1（图 2B）。这种定位与在ECM培养的肠道器官中观察到的这种定位形成鲜明对比。细胞外基质嵌入的器官染色核（DAPI）、VILLIN（图2C）和ZO-1（图2D）显示出一种细胞偏振，其中腹腔侧面对器官的流明。 需要完全切除ECM才能获得肠道器官的有效极性倒置。有时，在被ECM残留物包围的悬浮培养物中发现的部分器官，显示囊性形态，表明上皮的极性倒置失败（补充图2A）。对这些器官进行的免疫荧光染色分析，提供了核（DAPI）沿上皮的玄武岩位置和ZO-1在面对器官的流明（补充图2B）的表达的证据，证实不完整的ECM去除导致以类似于ECM嵌入器官的方式保留脊柱极性。 建立肠道单层培养的规程在播种后7天内产生汇流单层培养，文化往往在2-3天内达到汇合。成功的主要决定因素之一是用于播种单层细胞的数量和质量。 图3A，左面板 提供了一个理想播种密度约15万细胞在6.5毫米细胞培养膜插入的例子。这个数字不是固定的，可以根据捐赠者和来源器官培养的质量高度可变：因此，应根据这些变量优化单元格编号。如果播种密度太低，或质量差（图3A，右面板），可能没有足够的附件形成汇合单层文化。 一旦单层（图3B），细胞形成紧密的交汇点，形成鹅卵石外观（图3B，左面板）。如果他们不能形成一个汇合的单层（图3B，右面板），单层的外观往往是”补丁”，与区域质量良好的细胞附件，但这些区域之间的较大差距。这些文化在基底和尖层隔间之间没有提供功能屏障，也不适合描述的测定。一个汇合的单层将含有VILLIN的刷边朝向上皮的尖顶侧，其核定位在细胞的玄武岩杆（图4B）。在细胞之间，形成由多蛋白复合物（包括ZO-1）组成的细胞间结（图4B）。它们的存在是提供上皮文化的屏障功能的关键。 一旦汇流，向ALI文化的过渡就会诱发文化的进一步分化（图3C）。小，圆形的杯子细胞出现，单层本身采取一个更折叠的外观。虽然在水下培养物的上皮（图4A）中存在血小板细胞，但它们在ALI分化后更为突出。上皮内存在的血小板细胞分泌粘液，导致上皮顶部出现朦胧。通过染色分泌的粘液蛋白MUC2（图4A、C和D），可以可视化血小板细胞和分泌粘液，通过MUC2表达的增加（补充图3A）来测量血小板细胞种群的增加。没有必要去除这种凝胶状粘液层，它会粘在上皮的表面，并保持反复洗涤。如果需要去除，用粘液化合物（如 10 mM N 乙酰半胱氨酸或 50 μg/mL DTT）清洗培养物可去除多余的粘液。除了血小板细胞数量的增加，ALI界面还增加了肠内分泌细胞的存在（如CHGA表达）（补充图3B）和成熟肠细胞（如KRT20表达所示）（补充图3C）。 图1：肠道器官生成阶段。（A） 第 4 天具有所需尺寸的器官的圆顶代表图像（左面板、刻度栏 = 500 μm）。有机体是薄壁，有一个开放的发光隔间（右面板，刻度栏 = 100μm）。（B） 暂停 3 天后具有广泛聚合的井的代表图像（左面板、刻度栏 = 200 μm）。剪切后直接显示团块碎片的图像（右面板、刻度条 = 200 μm）。（C） 第7天在圆顶中肠道器官的代表图像。器官显示一个扩大的流明与小芽形成在上皮的玄武岩侧（左20倍放大，右100倍放大标记区域，刻度条 = 200μm）。（D） 肠道器官在 ECM 切除后的代表图像及随后的暂停培养 5 天。器官获得密集的形态与加厚的上皮，并暴露其尖面的介质。（左 20 倍放大，右 100 倍放大标记区域，刻度栏 = 200 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。 图2：肠道器官细胞极性标记的免疫荧光染色。以肠道器官为导向的肠道器官（A、B）和尖顶（C、D）被染有上皮标记ZO-1和VILLIN，并带有上皮标记E-CADHERIN（红色）。DAPI（蓝色）用于可视化核。左面板显示以 25 倍放大率拍摄的图像，右面板以 63 倍放大倍率显示不同器官的图像（仅面板 C 显示同一器官的 25 倍和 63 倍放大倍数）。（A） 被染有维林（绿色）和E-CADHERIN（红色）的肠道器官，表示腹膜侧暴露在介质上。（B） 沾有 ZO-1 （绿色） 和 E-CADHERIN （红色） 的肠道器官显示存在紧密的交汇点和脊柱细胞极性的回归。（C） 马特里格尔嵌入的肠道器官沾染有维林（绿色）和E-CADHERIN（红色），显示面向器官性流明的尖顶侧。（D） 染有ZO-1（绿色）和E-CADHERIN（红色）的马特里格尔嵌入肠道器官，表明器官的流明存在尖峰紧密的交汇点。（秤栏 = 100 μm）。器官被免疫荧光染色，并用先前公布的协议24，25成像。请单击此处查看此图的较大版本。 图3：建立肠道单层培养物。（A ）治疗后3D器官的代表形象，0.05%的试管素-EDTA。器官被分离到单细胞或小细胞团，为播种单层培养物做准备。左面板：单层培养物的最佳播种密度示例，在 6.5 mm 细胞培养膜插入器上，每 100 μL 约 150，000 个细胞。右面板：在 6.5 mm 细胞培养膜插入上，每 100 μL 的< 50，000 个细胞的次优播种密度示例。（B） 水下单层文化的代表亮场形象。左面板：100%汇流层，具有典型的鹅卵石外观。右面板：大约 50% 的汇流单层。由于肠道干细胞的持续增殖，单层（通过虚线指示）中的间隙会随着时间推移而缩小。（C） 代表 7 天差异化 ALI 文化的光明场形象。（秤栏 = 200 μm）。请单击此处查看此图的较大版本。 图4：单层培养物中差异化细胞标记的免疫荧光染色。（A ） 粘液蛋白 MUC2 水下单层培养物免疫荧光染色的 Z 堆栈图像，表示单层培养物培养物（绿色 = MUC2、蓝色 = DAPI）中存在血小板细胞。（B） 水下单层免疫荧光染色的 Z 堆栈图像。VILLIN 染色（绿色）沿着上皮的尖顶末端表示有刷边框，ZO-1 染色（红色）表示细胞之间有紧密的交汇点（蓝色 = DAPI）。（C） MUCIN 蛋白 MUC2 的 ALI 分化单层培养物免疫荧光染色 Z 堆图像，表明 ALI 单层培养物（绿色 = MUC2、蓝色 = DAPI）中存在数量显著增加的血小板细胞。（D） ALI 分化单层培养物的低温，染色为 MUC2（绿色）和 E-CADHERIN（红色）的存在，指示上皮中存在血小板细胞，以及单层培养物的尖顶侧粘液分泌。（秤栏 = 200 μm）。单层培养物被免疫荧光染色，并使用先前公布的协议26，27成像。请单击此处查看此图的较大版本。 补充图1：培养悬浮中肠道器官表型谱。 （A，B，C）肠道器官形态的其他代表性图像在 ECM 切除后 5 天内保持暂停状态。有机极性已经倒置。器官已经变得更加密集与加厚的上皮和器官的尖顶侧面向外。有机体可以显示各种形态：拉长（A）、囊性（B）和不规则（C）。（秤栏 = 100 μm）。 请点击这里下载此文件。 补充图2：肠道器官在悬浮培养物中存在残留的基底膜基质介质时，无法逆极。 （A） 不完全去除心电图和未能逆转器官极性的代表图像。甲基胶残留物存在于器官周围，有助于维持上皮极性导向的阿皮内。器官显示囊性形态，流明周围有薄上皮（鳞片条 = 200μm）。（B） 悬浮培养条件下发现的非倒置器官的代表图像。核（蓝色 = DAPI） 和 E-CADHERIN（红色）位于玄武岩侧，ZO-1（绿色）表示为面向器官流明的尖顶侧。（秤栏 = 100 μm）。 请点击这里下载此文件。 补充图3：单层培养物中分化细胞标记的基因表达。（A，B，C）在肠道器官分化介质中产生的淹没和 ALI 分化单层培养物中，与通过 qPCR 建立的肠道器官扩张介质生长的 3D 器官培养物形成的MUC2、CHGA和KRT20的表达。 建立水下单层培养物可增加每个有区别的细胞标记的表达：然而，作为 ALI 文化的差异化会成倍增加每个标记的表达。错误栏 + /- SEM.请单击此处下载此文件。 单层文化软件 肠道器官收获井数（从50微升圆顶/每口要播种的井） 6.5 毫米跨井插入 1 – 2 口井 12 毫米跨井插入 3 – 4 口井 6 井板 6 – 8口井 24 井板 3 – 4 口井 96井板 1 – 2 口井 表1：各种培养皿收获的肠道器官井数
Discussion
表皮器官模型已成为强大的平台，可用于模型组织组织，疾病进展，并识别治疗23，28，29。器官微注射对器官模拟传染病的能力具有附加价值，因为它允许病原体与宿主上皮的腹侧相互作用。微注射技术的最新进展优化了器官的注射速度，并达到了每小时90个注射器官的速度。注射器官的屏障功能得以保留，流明内的低氧浓度使强制性厌氧注射细菌得以存活。然而，研究已经注意到同一井内器官种群中存在异质性。这些差异在大小和形状31，表达水平的关键基因32，以及增殖率33。同一器官种群内对福斯科林和PGE2等化合物或霍乱毒素的不同反应也被描述为28，33。这些结果突出了研究中高器官数的必要性，并限制了发光注射的使用。
传统的器官培养基于水凝胶中器官的封装和繁殖。然而，水凝胶会对扩散造成限制，并引入浓度梯度，从而增加异质性34。此外，不仅在文化和捐助者之间，而且在个别实验条件下，都记录了高变异性。水凝胶的供体来源、生化特性以及器官作为培养系统的内在异质性是增加实验变异性、限制下游应用成果可重复性的重要因素。这里描述的两种方法都提供了一个简单的方法来暴露上皮的尖顶侧，允许通过直接将化合物和病原体添加到培养介质中来建模。水凝胶利用率的降低可以限制技术误差源的实验变异性。
与2D单层相比，肠道外器官保留了器官模型系统的关键特征，其可伸缩性使其更适合于高通量检测。然而，由于器官保留了其3D结构，基础侧的可访问性有限，并可能阻碍同时访问双方的研究。
我们已经证明，肠道器官的极性倒置依赖于ECM的有效和绝对去除，同时保持器官的完整结构。使用分离溶液去除 ECM 和防粘附溶液以防止有机体粘附到塑料器皿有助于提高 Co、J. Y. 及其同事22日公布的协议的整体效率，特别是在为下游应用生产的甲形器官数量方面。
此外，我们观察到，我们的协议支持更有效地反转小于250μm的器官，使用较大的器官可能导致器官输出减少，由于管道造成的碎片。宽孔尖端，如 材料表中指出的提示，可能允许使用较大的器官。然而，与标准尖端相比，宽孔尖端在 ECM 分离方面效果较差，因为应用机械力较低。因此，在处理较大的器官时，可能需要重复步骤 1.2.9-1.2.11，以便充分中断和完全清除所有 ECM 残留物。
悬浮的有机物至少可以存活2周。经过这段时间，我们观察到形态的变化和细胞死亡的增加。在体外器官22 中增殖细胞的存在允许肠道器官培养的重新建立。这可以通过将体外器官分离到单个细胞中，并将它们嵌入到ECM中与肠道器官扩张介质中来实现。
描述在悬浮培养物中建立肠道器官的协议中经常遇到的一个限制是大聚合物的生成。这会影响几个变量，如效率、形态特征的可重复性、化合物的渗透性和准克里恩信号。与 Co、J. Y. 及其同事发布的协议类似，在此处我们确认，在暂停 3 天后，至少 97% 的悬浮器官在未剪切的情况下获得了极性倒置。然而，与出版物相反，我们引入了机械分离步骤，以减少大集料的形成和提高产量。由于此程序可能会损害器官的上皮，我们延长了器官的潜伏期2天，以便完全上皮恢复，并确保下游应用的高质量培养。使用孵化器摇床或微调器烧瓶引入持续搅拌，可潜在地减少融合事件，最大限度地减少碎片化，并增加氧合。这些替代方法可以维持培养更长的时间，减少细胞死亡，并允许进一步分化的肠道器官。
与倒置极性器官相比，建立器官衍生的2D单层提供了若干优点和缺点。此处描述的协议允许快速建立汇流单层文化，通常在 7 天内建立，并可以选择长期维护文化（长达 10 周）。这里使用的协议和介质也允许有效区分大量的细胞，并不总是发现在其他器官衍生的单层培养物16。在细胞培养物插入膜上建立单层，可以同时访问上皮的顶点和玄武岩两侧，使其成为研究屏障完整性和上皮运输的理想之选。这种简化的获取也使他们更容易接受感染和药物治疗研究。此外，这些文化保持了捐赠者特有的许多特征，保持了它们与患者特定研究的相关性。ALI培养方法还有助于区分由分泌细胞和吸附细胞类型组成的功能更强的上皮，使其更能代表人类肠道上皮。这些文化的相对稳定性也使它们能够长期保持，为长期研究提供了可能性。然而，这种方法的局限性是建立汇流单层所需的大量细胞，以及保持完全的汇流，以便在圆锥体和玄武岩室之间进行功能分离的需要。在建立单层文化时，也可以在3D器官文化中建模的特有的墓穴结构丢失。然而，实验友好的文化形式和上皮的顶点和玄武岩侧可以很容易地访问，使其成为肠道生理学研究的有力工具。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由 Horizon 2020 赠款 OrganoVIR 812673资助，该项目是病毒研究器官 – 一个创新的培训-ITN 方案。
Materials
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
| Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
| Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
| Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
| Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
| Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
| IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
| Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |
Referenzen
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity – Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
- DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
- Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhang, Y. -. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
- Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -. H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
- Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
- Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn’s & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, &. #. 2. 1. 4. ;. H. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
- Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
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Stroulios, G., Stahl, M., Elstone, F., Chang, W., Louis, S., Eaves, A., Simmini, S., Conder, R. K. Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models. J. Vis. Exp. (169), e62330, doi:10.3791/62330 (2021).