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Abstract
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Immunologie und Infektion

Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Abstract

Gli studi di genomica funzionale del sistema immunitario richiedono manipolazioni genetiche che comportano sia la delezione di geni bersaglio che l’aggiunta di elementi alle proteine di interesse. L’identificazione delle funzioni geniche in modelli di linee cellulari è importante per la scoperta e l’esplorazione dei meccanismi intrinseci delle cellule. Tuttavia, le manipolazioni genetiche delle cellule immunitarie come le cellule T e le linee cellulari dei macrofagi utilizzando il knock-in mediato da CRISPR / Cas9 sono difficili a causa della bassa efficienza di trasfezione di queste cellule, specialmente in uno stato quiescente. Per modificare i geni nelle cellule immunitarie, la selezione della resistenza ai farmaci e i vettori virali sono tipicamente utilizzati per arricchire le cellule che esprimono il sistema CRIPSR / Cas9, il che si traduce inevitabilmente in un intervento indesiderato delle cellule. In uno studio precedente, abbiamo progettato due reporter fluorescenti accoppiati a CRISPR / Cas9 che sono stati espressi transitoriamente dopo l’elettroporazione. Questa soluzione tecnica porta a una rapida delezione genica nelle cellule immunitarie; tuttavia, il knock-in genico nelle cellule immunitarie come le cellule T e i macrofagi senza l’uso della selezione della resistenza ai farmaci o dei vettori virali è ancora più impegnativo. In questo articolo, mostriamo che utilizzando lo smistamento cellulare per aiutare la selezione di cellule che esprimono transitoriamente costrutti CRISPR / Cas9 che prendono di mira il locus Rosa26 in combinazione con un plasmide donatore, il knock-in genico può essere ottenuto sia nelle cellule T che nei macrofagi senza arricchimento della resistenza ai farmaci. Ad esempio, mostriamo come esprimere ACE2 umano, un recettore di SARS-Cov-2, responsabile dell’attuale pandemia di Covid-19, nei macrofagi RAW264.7 eseguendo esperimenti knock-in. Tali cellule knock-in geni possono essere ampiamente utilizzate per studi meccanicistici.

Introduction

Le cellule immunitarie sono fondamentali per la difesa contro gli agenti patogeni. Sia l’immunità innata che quella adattativa sono necessarie per la clearance degli infettanti e il mantenimento dell’omeostasi tissutale1,2. I modelli di linee cellulari sono strumenti essenziali per comprendere i fondamenti molecolari del sistema immunitario dei mammiferi; sono utilizzati in saggi funzionali in vitro, come quelli che modellano l’attivazione delle cellule T umane, e nel determinare la funzione dei fattori genetici nell’attivare o smorzare le risposte immunitarie3,4. È importante notare che il sistema immunitario dei mammiferi è enormemente eterogeneo e, altrettanto importante, un numero enorme di molecole controlla la differenziazione, la migrazione e la funzione di un dato tipo di cellula5,6.

Gli strumenti di editing del genoma CRISPR /Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) consentono la manipolazione genetica di specifici tipi di cellule, che facilita l’annotazione funzionale dei geni in modo preciso7,8. Diversi protocolli pubblicati hanno descritto la somministrazione di CRISPR / Cas9 sotto forma di complessi di RNA Guida Cas9 noti come ribonucleoproteine (RNP) in cellule HEK293, linee cellulari Jurkat, cellule T primarie9,10, macrofagi11,12,13, cellule staminali14e altri15,16. In questi protocolli, il gene tagging è solitamente ottenuto fondendo un tag fluorescente alle proteine endogene17,18. Tuttavia sono stati fatti pochi tentativi di utilizzare due reporter fluorescenti, che sono compatibili con lo smistamento a singola cellula, per facilitare gli esperimenti knock-in19,20, in particolare nelle cellule immunitarie.

Analisi meccanicistiche approfondite volte a comprendere le funzioni di un nuovo fattore genetico nelle cellule immunitarie richiedono generalmente la delezione specifica del tipo cellulare di un gene, esperimenti di salvataggio genetico e idealmente l’identificazione dei suoi interattori. Anche se i metodi per l’ottimizzazione della delezione genetica dei geni nelle cellule immunitarie sono stati pubblicati9,15,21,sono stati segnalati molti meno metodi per introdurre alleli knock-in con funzioni versatili per comprendere la risposta immunitaria. Pertanto, in questo protocollo ci proponiamo di descrivere in dettaglio un protocollo efficiente e altamente riproducibile per esprimere una proteina di interesse (POI) al locus Safe Harbor Rosa26 in linee cellulari immunitarie sia umane che murine. Abbiamo progettato un sistema reporter a due colori per arricchire le cellule trasfettate con plasmidi che esprimono CRISPR/Cas9 (DsRed2) e un modello di DNA ricombinante (EBFP2), che può essere isolato mediante selezione cellulare. Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto più linee knock-in della linea di cellule T umane Jurkat e del macrofago murino RAW264.7 per analisi funzionali di proteine scarsamente studiate.

Ad esempio, mostriamo in questo protocollo come ottenere macrofagi RAW264.7 knock-in che esprimono stabilmente ACE2 umano (un recettore di SARS-Cov-2)22. Poiché le cellule immunitarie innate sono coinvolte nella patogenesi di Covid-1923,24 e l’ACE2 umano è considerato un recettore principale richiesto per l’ingresso virale nelle cellule prima della replicazione, i macrofagi con knock-in di ACE2 umano possono servire come strumento utile per studi meccanicistici di moltiplicazione virale all’interno dei macrofagi. Parallelamente, presentiamo anche un esempio di knock-in di un gene nel locus umano ROSA26 per esprimere la proteina RASGRP1, che è stata fusa al suo terminale amminico con un’affinità Twin-Strep-tag (OST). Le cellule T sono cellule bersaglio chiave nelle terapie immunitarie e un numero crescente di studi si è concentrato sulla manipolazione della loro reattività al cancro25,26. Poiché Rasgrp1 è noto per essere una molecola di segnalazione chiave a valle del recettore delle cellule T e i suoi interattori non sono ben chiariti27, il modello knock-in OST-RASGRP1 fornisce le basi per identificare gli interattori che regolano la risposta delle cellule T ai tumori e alle infezioni. Presi insieme, questi strumenti possono essere utilizzati per gli studi Covid-19 e la scoperta di nuove molecole che interagiscono con Rasgrp1.

Protocol

1. Progettazione e costruzione di plasmidi di sgRNA destinati al locus Rosa26 Guida alla progettazione RNA intorno al sito di inserimento desiderato Assicurarsi che il sito di inserimento per gli esperimenti knock-in del topo Rosa26 (di seguito designato come mRosa26) si trovi nel primo introne di mRosa26; questo sito è stato utilizzato in studi precedenti28,29. Per gli esp…

Representative Results

Seguendo il protocollo sopra descritto per eseguire esperimenti knock-in presso il locus mRosa26 utilizzando macrofagi murini RAW264.7, abbiamo progettato un vettore di targeting per esprimere ACE2 umano, un recettore per il virus SARS-Cov-2 (Figura 2A). Utilizzando un design simile, abbiamo generato cellule T Jurkat umane con knock-in della proteina di fusione RASGRP1 con tag OST (Figura 2C). Dopo la trasfezione di tre plasmidi, due dei quali sono stat…

Discussion

Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato come eseguire l’editing knock-in nelle cellule immunitarie dalla progettazione del costrutto allo screening e alla convalida delle cellule knock-in utilizzando cellule T Jurkat umane e macrofagi RAW264.7 murini come esempi. Sia le linee cellulari delle cellule T che delle macrofaghe sono resistenti alla trasfezione36,37; tuttavia, il problema della bassa efficienza della consegna CRISPR / Cas9 può essere superato con l’…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la struttura principale della citometria a flusso della Xinxiang Medical University. Lo sviluppo di tale tecnologia è stato sostenuto da sovvenzioni NSFC 81601360 a LZ, 81471595 e 32070898 a YL. Il lavoro è anche sostenuto dalla Fondazione del Comitato Educativo dell’Henan n. 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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Referenzen

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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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