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Abstract
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Immunologie und Infektion

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

Ce protocole utilise des rapporteurs fluorescents et le tri cellulaire pour simplifier les expériences d’entraînement dans les macrophages et les lignées cellulaires T. Deux plasmides sont utilisés pour ces expériences d’entraînement simplifiées, à savoir un plasmide exprimant CRISPR/Cas9 et DsRed2 et un plasmide donneur de recombinaison homologue exprimant EBFP2, qui est intégré en permanence au locus Rosa26 dans les cellules immunitaires.

Abstract

Les études de génomique fonctionnelle du système immunitaire nécessitent des manipulations génétiques qui impliquent à la fois la délétion des gènes cibles et l’ajout d’éléments aux protéines d’intérêt. L’identification des fonctions des gènes dans les modèles de lignées cellulaires est importante pour la découverte de gènes et l’exploration des mécanismes intrinsèques des cellules. Cependant, les manipulations génétiques des cellules immunitaires telles que les cellules T et les lignées cellulaires de macrophages utilisant l’entraînement médié par CRISPR / Cas9 sont difficiles en raison de la faible efficacité de transfection de ces cellules, en particulier dans un état de repos. Pour modifier les gènes dans les cellules immunitaires, la sélection de la résistance aux médicaments et les vecteurs viraux sont généralement utilisés pour enrichir les cellules exprimant le système CRIPSR / Cas9, ce qui entraîne inévitablement une intervention indésirable des cellules. Dans une étude précédente, nous avons conçu des rapporteurs fluorescents doubles couplés à CRISPR / Cas9 qui ont été exprimés transitoirement après électroporation. Cette solution technique conduit à une délétion rapide des gènes dans les cellules immunitaires; cependant, l’inserment de gènes dans les cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les macrophages sans l’utilisation de la sélection de la résistance aux médicaments ou de vecteurs viraux est encore plus difficile. Dans cet article, nous montrons qu’en utilisant le tri cellulaire pour faciliter la sélection de cellules exprimant transitoirement les constructions CRISPR / Cas9 ciblant le locus Rosa26 en combinaison avec un plasmide de donneur, le knock-in de gène peut être réalisé à la fois dans les cellules T et les macrophages sans enrichissement en résistance aux médicaments. À titre d’exemple, nous montrons comment exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du SARS-Cov-2, responsable de la pandémie actuelle de Covid-19, dans les macrophages RAW264.7 en effectuant des expériences knock-in. De telles cellules knock-in génétiques peuvent être largement utilisées pour les études mécanistes.

Introduction

Les cellules immunitaires sont essentielles à la défense contre les agents pathogènes. L’immunité innée et adaptative est nécessaire pour l’élimination des infectieux et le maintien de l’homéostasie tissulaire1,2. Les modèles de lignées cellulaires sont des outils essentiels pour comprendre les fondements moléculaires du système immunitaire des mammifères; ils sont utilisés dans des tests fonctionnels in vitro, tels que ceux modélisant l’activation des lymphocytes T humains, et pour déterminer la fonction des facteurs génétiques dans l’activation ou l’amortissement des réponses immunitaires3,4. Il est important de noter que le système immunitaire des mammifères est extrêmement hétérogène et, tout aussi important, un grand nombre de molécules contrôlent la différenciation, la migration et la fonction d’une cellule donnée de type5,6.

Les outils d’édition du génome CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permettent la manipulation génétique de types cellulaires spécifiques, ce qui facilite l’annotation fonctionnelle des gènes de manière précise7,8. Plusieurs protocoles publiés ont décrit l’administration de CRISPR/Cas9 sous la forme de complexes d’ARN guides Cas9 connus sous le nom de ribonucléoprotéines (RRP) dans les cellules HEK293, les lignées cellulaires Jurkat, les cellules T primaires9,10,les macrophages11,12,13,les cellules souches14et d’autres15,16. Dans ces protocoles, le marquage génique est généralement réalisé en fusionnant une étiquette fluorescente à des protéines endogènes17,18. Cependant, peu de tentatives ont été faites pour utiliser des rapporteurs fluorescents doubles, qui sont compatibles avec le tri des cellules uniques, pour faciliter les expériencesknock-in 19,20, en particulier dans les cellules immunitaires.

Les analyses mécanistes approfondies visant à comprendre les fonctions d’un nouveau facteur génétique dans les cellules immunitaires nécessitent généralement la délétion spécifique d’un gène par type cellulaire, des expériences de sauvetage génétique et, idéalement, l’identification de ses interacteurs. Même si des méthodes d’optimisation de la délétion génétique des gènes dans les cellules immunitaires ont été publiées9,15,21, beaucoup moins de méthodes ont été rapportées pour introduire des allèles knock-in avec des fonctions polyvalentes pour comprendre la réponse immunitaire. Par conséquent, dans ce protocole, nous visons à décrire en détail un protocole efficace et hautement reproductible pour exprimer une protéine d’intérêt (POI) au locus refuge Rosa26 dans les lignées cellulaires immunitaires humaines et murines. Nous avons conçu un système rapporteur bicolore pour enrichir les cellules transfectées avec des plasmides exprimant CRISPR/Cas9 (DsRed2) et un modèle d’ADN recombinant (EBFP2), qui peut être isolé par tri cellulaire. Suite à ce protocole, nous avons obtenu plusieurs lignées knock-in de la lignée de cellules T humaines Jurkat et du macrophage murin RAW264.7 pour des analyses fonctionnelles de protéines mal étudiées.

À titre d’exemple, nous montrons dans ce protocole comment obtenir des macrophages RAW264.7 knock-in exprimant de manière stable l’ACE2 humain (un récepteur du SARS-Cov-2)22. Parce que les cellules immunitaires innées sont impliquées dans la pathogenèse du Covid-1923,24 et que l’ACE2 humain est considéré comme un récepteur majeur nécessaire à l’entrée virale dans les cellules avant la réplication, les macrophages avec knock-in de l’ACE2 humain peuvent servir d’outil utile pour les études mécanistes de la multiplication virale à l’intérieur des macrophages. En parallèle, nous présentons également un exemple de knock-in d’un gène au locus humain ROSA26 pour exprimer la protéine RASGRP1, qui a été fusionnée à son extrémité aminée avec une affinité Twin-Strep-tag (OST). Les lymphocytes T sont des cellules cibles clés dans les thérapies immunitaires, et un nombre croissant d’études se sont concentrées sur la manipulation de leur réactivité au cancer25,26. Comme Rasgrp1 est connu pour être une molécule de signalisation clé en aval du récepteur des lymphocytes T et que ses interacteurs ne sont pas bien élucidés27,le modèle d’inserrage OST-RASGRP1 fournit la base pour identifier les interacteurs régulant la réponse des lymphocytes T aux tumeurs et aux infections. Pris ensemble, ces outils peuvent être utilisés pour les études Covid-19 et la découverte de nouvelles molécules interagissant avec Rasgrp1.

Protocol

1. Conception et construction plasmidique de sgRNA ciblant rosa26 Locus Guide de conception des ARN autour du site d’insertion souhaité S’assurer que le site d’insertion des expériences de frappe de souris Rosa26 (ci-après dénommée mRosa26)est situé dans le premier intron de mRosa26; ce site a été utilisé dans des études antérieures28,29. Pour les expérienc…

Representative Results

Suivant le protocole décrit ci-dessus pour effectuer des expériences knock-in au locus mRosa26 en utilisant des macrophages murins RAW264.7, nous avons conçu un vecteur de ciblage pour exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du virus SARS-Cov-2(Figure 2A). En utilisant une conception similaire, nous avons généré des cellules T Jurkat humaines avec l’apport de la protéine de fusion RASGRP1 marquée OST (Figure 2C). Après la transfection de troi…

Discussion

Dans nos expériences, nous avons démontré comment effectuer l’édition knock-in dans les cellules immunitaires, de la conception de la construction au criblage et à la validation des cellules knock-in, en utilisant les cellules T Jurkat humaines et les macrophages murins RAW264.7 à titre d’exemples. Les lignées cellulaires de lymphocytes T et de macrophages sont résistantes à la transfection36,37; cependant, le problème de la faible efficacité de la…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université médicale de Xinxiang. Le développement de cette technologie a été soutenu par des subventions de la NSFC 81601360 à LZ, 81471595 et 32070898 à YL. Le travail est également soutenu par la Fondation du Comité éducatif du Henan n ° 21IRTSTHN030.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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Referenzen

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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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