人体外伤模型和全山染色方法，以准确评估皮肤修复

人类皮肤是在城堡山医院和赫尔皇家医务室（英国赫尔）接受重建手术的患者在充分知情、书面患者同意、机构指南和道德认可（LREC：17/SC/0220 和 19/NE/0150）下获得的。非糖尿病皮肤是从接受常规手术的患者（平均年龄 = 68 岁）收集的。糖尿病皮肤是从已确定II型糖尿病和溃疡史（平均年龄 = 81 岁）的捐赠者中挑选出来的。手术样本在手持介质中运输，抵达实验室后立即处理。使用未修复的人体组织的所有实验步骤均在生物安全级 2 （BSL-2） 中执行，该步骤位于 II 类层压流生物安全柜中。 1. 皮肤培养介质和染色试剂的制备 注：所有试剂和耗材详情均在 材料表中提供。确保用于人体组织加工和培养的所有试剂和设备都是无菌的。使用前对仪器进行消毒，在与组织接触后用消毒剂消毒。处置前将废品在1%消毒剂中净化。 持有介质：补充高葡萄糖杜尔贝科的改良鹰中等（DMEM）与2mM L-谷氨酰胺和4%（v/v）抗生素抗菌解决方案。 汉克的平衡盐溶液 （HBSS） 与抗生素： 添加 4% （v/v） 抗生素抗菌解决方案到 HBSS.在 4 °C 下存储，直到使用。 杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）： 通过每升蒸馏水溶解 9.6 克 DPBS 粉末 （dH2O） 来准备 DPBS。高压灭菌，并在 4 °C 下储存，直到使用。 人类皮肤生长介质：补充高葡萄糖DMEM与2mM L-谷氨酰胺，1%（v/v）抗生素抗肌酸溶液和10%（v/v）胎儿牛血清。在 4 °C 下存储，直到使用。 皮肤固定剂：至450 mL dH2O，加入40mL甲醛溶液、10mL冰川醋酸、4.5克氯化钠和0.25克溴化铝。在室温下存储（RT），并在几天内使用。警告：固定剂是危险的（刺激性和易燃性）。小心处理，并通过适当的路线处理。 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：通过在100 mL磷酸盐缓冲液和900 mL dH2O中加入6克氯化钠，为全安装染色做好准备。 染色洗涤缓冲器：在 PBS 中溶解 0.5% （v/v） 特里顿 X-100。 阻塞缓冲器：在染色洗涤缓冲器中加入 0.2% （w/v） 钠阿齐德和 2% （v/v） 动物血清。在 4 °C 下存放长达两周。注：阻断二级抗体宿主物种的血清。阿齐德钠在孵化过程中可以防止细菌生长。 DAPI 工作解决方案：在硫化二甲基 （DAPI） 中准备 5 毫克/mL 的 4+、6-二甲基二苯丙胺 （DAPI） 库存。在染色洗涤缓冲器中稀释库存 1：1，000，以提供 5 μg/mL DAPI 工作解决方案。 过氧化酶块：在染色洗涤缓冲器中加入0.3%（v/v）过氧化氢。在 4 °C 下存储，直到使用。保持在黑暗中，以防止分解。 ABC-HRP 套件： HRP 结合二级抗体：5 mL 染色缓冲器中 1 滴生物染色兔抗山羊 Igg。在 4 °C 下存放长达两周。注：使用的试剂盒/二次将取决于原发性抗体的宿主物种。 阿维丁生物素复合物 （ABC） 试剂：2 滴试剂 A 和 2 滴试剂 B 在 5 mL 的染色洗涤缓冲器中。ABC 试剂应在使用前至少 30 分钟准备。在 4 °C 下存放长达两周。 过氧化物酶基板：3滴试剂1，2滴试剂2，2滴试剂3和2滴过氧化氢在5mL dH2O.过氧化酶基板应在使用前立即准备，不能存储。 2. 为伤口准备皮肤 注：这些步骤应在 II 类层压流生物安全柜中执行。 收集持有介质和运输到 BSL-2 机柜的皮肤。 将皮肤真皮侧放在90毫米无菌的培养皿内，用无菌剪刀切除脂肪组织。 将皮肤放在含有 25 mL HBS 的 50 mL 管中，在 RT 处使用抗生素 10 分钟。间歇性摇动以去除任何残留的血液和脂肪组织。 使用新的 50 mL 管重复步骤 2.3。 将皮肤放在含有 25 mL HBSS 的新鲜 50 mL 管中，这次在 RT 10 分钟内不使用抗生素。 将皮肤放入 25 mL DPBS 的新管中，进行最后的皮肤冲洗。皮肤现在准备伤口了。 3. 制造前体内人体皮肤伤口 注：这些步骤应在 II 类层压流生物安全柜中执行。 受伤前准备皮肤培养菜肴。在 60 mm Petri 菜肴中，堆叠两个无菌吸水垫，并通过菜的侧面添加 4 mL 的人体皮肤介质。将无菌尼龙过滤膜放在吸水垫堆栈上。注意：皮肤介质可以根据所需的治疗条件进行更改。每个堆栈上最多可培养三个伤口外植物。 在 90 mm Petri 盘中干燥无菌纱布上皮肤的皮肤侧，以去除残留的 DPBS。注意：这可以防止皮肤在受伤时滑动。 将皮肤真皮侧放在干净的 90 mm Petri 菜盖上，用新鲜的无菌纱布擦干表皮。注意：在培养皿盖中伤口皮肤比在底座上更容易。应迅速开展后续工作，防止皮肤干燥。 紧握皮肤，用2毫米活检拳压住皮肤，轻轻扭动。不要完全打穿皮肤。注：部分厚度伤口设计用于冲穿表皮，部分打入真皮。创建部分厚度伤口所需的力中可能有捐赠者对捐赠者和现场到现场的变异性。 使用弯曲的齿形组织钳子拾取 2 mm 伤口的每一侧，并在 2 mm 伤口下钩住弯曲的虹膜剪刀，使其均匀切除。 使用 6 mm 活检冲床对中央 2 毫米伤口进行活检，在中心创建部分厚度为 2 mm 伤口的 6 mm 外植。注：6 毫米活检冲床可用于标记皮肤，以标记每个 2 mm 伤口的位置。小心不要完全穿透组织。以蜂窝模式创建伤口外植，以减少浪费。 将伤口外皮侧放在尼龙过滤膜堆栈上（以第 3.1 步准备）。注意：处理伤口外植时，请注意不要损坏中心伤口。使用小钳子，在对面捡起每个外生植物。 在潮湿的大气（90-95%）中将伤口在 32-37 °C 和 5% CO2 中孵育 1-7 天。每 2-3 天更换一次媒体。 4. 前体外伤口的全安装污渍 注：本节描述了免疫荧光和免疫过氧化酶染色方法。使用前混合所有试剂。 荧光染色方法 在 1.5 mL 微中心管中收集伤口外植物，其中含有 500 μL 的皮肤固定剂，并在 4 °C 下孵育过夜。注：此协议中使用的固定剂适用于描述的抗体。其他抗体需要优化。组织固定时间超过 24 小时可能导致过度固定。 第二天取出固定剂，代之以 1 mL 的染色洗涤缓冲器。活检可在染色前 4 °C 至 2 周储存在染色洗涤缓冲器中。注意：对于所有洗涤缓冲步骤，使用血清移液器或移液器尖端，注意不要损坏伤口。 吸气染色洗涤缓冲器，并用 1 mL 的染色洗涤缓冲器再冲洗一次。 计算步骤 4.1.5-4.1.6 所需的阻塞缓冲器量（样本数量 x 300 μL = μL 中的阻塞缓冲器数量）。如有必要，提供额外的缓冲。 在每个样品中加入 150 μL 的阻隔缓冲器，并在 RT 孵育 1 小时。对于所有染色步骤，确保每个样品都有足够的覆盖，并且没有覆盖活检伤口表面的气泡。注：此步骤可在 1.5 mL 微中心管或 48 井板中执行。如果使用 48 井板，则将伤口朝下孵育在每口井中。 在剩余的阻塞缓冲器中稀释主要抗体。注：防鼠角蛋白14（K14）稀释1：1，000在阻塞缓冲效果良好。优化此步骤以用于其他抗体或多个探头。 吸气阻塞缓冲器，每口井/微中原管添加150微升原发性抗体。在 4 °C 的一夜之间在原位抗体中孵育伤口除植物。 第二天，在RT（每个样品500微升）中，将含有0.2%钠阿齐德的原发性抗体和冲洗液吸气。 使用染色洗涤缓冲器（每次洗涤 30 分钟，每个样品 500 μL）再执行三个冲洗步骤。 在染色洗涤缓冲器中稀释荧光结合的二级抗体（例如，山羊抗鼠标 488 在 1：400 稀释）中。 计算所需的二级抗体量（样本数量 x 150 μL = μL 中的量）。 在每个井/微中心管中加入 150 μL 的二级抗体。在 RT. 在 RT 下孵育 1 小时， 在黑暗中执行孵化步骤 4.1.10 – 4.1.16， 因为次要抗体对光敏感。注意：如果需要，此步骤可以在 4 °C 的夜间执行。优化足够信号和有限背景染色所需的二次抗体浓度。 去除二级抗体，用染色洗涤缓冲器（每个样品 500 μL）进行 3 x 30 分钟的冲洗。 丢弃剩余的洗涤缓冲器并计算所需的 DAPI 工作解决方案量（根据步骤 4.1.11）。 在 Rt 用 150 μL 的 DAPI 工作解决方案对每个外植物进行计数， 持续 10 分钟。注：DAPI 将染色细胞核蓝色。霍奇斯特染料可以用作 DAPI 的替代品。 用染色洗涤缓冲器（每个样品 500 μL）进行最后两次 30 分钟洗涤。活检可在成像前两周在黑暗中 4 °C 的染色洗涤缓冲器中存储。 布莱特菲尔德染色方法。 执行步骤 4.1.1 – 4.1.3。 在 4 °C 的夜间用过氧化酶块奎奇内源过氧化酶活性。注：此步骤在使用 HRP 结合抗体以减少组织中的非特定背景染色时非常重要。高度血管化的组织将包含更多的内源性过氧化酶活性。 丢弃过氧化酶块，在染色洗涤缓冲器中冲洗两次，持续 30 分钟。 执行步骤 4.1.4 – 4.1.8。注：第 4.1.7 步后洗涤对于从样品中去除阿齐德钠尤为重要。如果钠酸钠未充分去除，它将使 HRP 失活并干扰染色检测。 在每个井/微中心管中加入 150 μL HRP 结合的二级抗体，并在 RT 的 4 °C 或 1 h 孵育过夜。 去除二级抗体，在染色洗涤缓冲器中进行 3 x 30 分钟的洗涤。 在每个井/微中心管中加入 150 μL ABC 试剂，并在 4 °C 或 RT 的 1 小时孵育过夜。 吸气 ABC 试剂，在染色洗涤缓冲器中进行 3 x 30 分钟的洗涤。 将 150 μL 过氧化酶基板添加到一个外植物中，并确定检测明显颜色变化所需的时间。注意：选择预期有强污渍的示例。在这种情况下，一个红色的戒指，以显示迁移表皮（K14）。3，3′-二恶氮-4，或任何其他适当的染色基质，可以用作这种过氧化酶基质的替代品。 一旦观察到颜色变化，取出过氧化酶基板，代之以 1 mL dH2O。 重复对其他外生植物的过氧化酶基板检测，在步骤 4.2.11 确定的时间内进行孵育。 用 1 mL dH2O 冲洗所有外植物，去除残留过氧化酶基板。虽然在成像前，在 4 °C 下最多可以储存一周，但最好尽快对它们进行成像，以防止过氧化酶基板随着时间的推移渗入 dH2O 中。 5. 成像和量化 荧光成像注：荧光成像使用共聚焦激光扫描显微镜进行。但是，倒荧光显微镜可能足以获取 2D 图像来量化伤口闭合率。在选择二级抗体时，确保所选的荧光片与现有显微镜设备的激发和发射光谱相容。 使用配备 2.5 倍、10 倍和 20 倍目标、x-y-z 电动舞台、数码相机和采集软件的共聚焦激光扫描显微镜。打开传输的光探测器 （TPMT），以便轻松可视化每个活检，并实现伤口完全闭合的测量。或者，在荧光成像后通过亮场显微镜测量每个伤口。 在成像平台上放置一个 60 mm 的 Petri 菜底座，并添加 DPBS 的薄层（约 1 mL）。注意：如果使用过多的DPBS，活检将在成像过程中移动。或者，如果有板架可用，则使用 48 井板。 使用小组织钳子将伤口外植物从井/微中心管转移到含有DPBS的培养皿中。将活检伤口侧放在培养皿中。 使用目镜和荧光灯定位并聚焦于伤口。如果气泡被困在视野中的样本下，则用组织钳子拾起伤口并重新定位。 设置成像软件，确保通道之间的针孔大小相等，以获得最佳的共聚焦性。为此，检查每个通道一个通风单元的价值，并选择最大值。选择扫描速度、图像质量和平均值。注：结合的二次抗体和所选计数器（例如 DAPI）的荧光片将决定所需的通道。 打开实时采集软件，将每个通道的激光功率和增益调整到可视化染色所需的水平。通过增加数字偏移来减少背景噪音。 将伤口放置在成像平面的中心。注意：如果伤口因使用较小的目标或创建较大的伤口而无法填充整个图像，请拍摄图像面板并将它们拼接在一起（手动或在相关成像软件中具有瓷砖功能）。 获取伤检图像。在外植之间使用相同的成像设置。注：更高的功率图像将允许对组织结构和细胞标记表达和位置进行评估。 收集串行 Z 堆栈通过伤口，特别是当组织不是完全平对培养皿。使用分析软件将 Z 堆栈折叠成单个最大强度投影图像。 布莱特菲尔德成像注：可以多种方式进行免疫过氧化酶染色活检的布莱特菲尔德成像。 倒置显微镜成像：将伤口植入培养皿/以及步骤 5.1.2-5.1.3 中描述的伤口外植植物进行成像。在装有数码相机的倒置显微镜上获得亮场照明下的数字图像。如果需要，将多个图像拼接在一起。 无线数字显微镜成像：使用连接到手机或笔记本电脑的无线数字显微镜以经济高效的方式获取高质量图像。将外植物侧面涂在某些组织上，并从样品储存中取出任何残留的 dH2O（或染色洗涤缓冲器）。将伤口植入显微镜视野的中心。使用连接的摄像机获取图像。 量化注：任何允许绘制和测量手形的软件都可以量化百分比伤口封闭。ImageJ 可用于执行以下量化： 打开图像以在 ImageJ 软件中量化。 使用徒手形状工具在重新上皮的伤口外部绘制，使其符合正常皮肤。按 M（ 或 分析|测量）获取”外部”区域测量。注：重新上皮的伤口组织纹理不同于正常皮肤。在进行此类分析之前，无需对图像进行缩放。 使用徒手形状工具在开放的伤口区域周围绘制。这是开放性伤口与重新上皮组织内边缘相遇的地方。按 M（ 或 分析|测量）获得”内部”区域测量。 使用以下方程推断百分比伤口重新表皮化/关闭：% 封闭 = （外伤区 – 内伤区） / （外伤区） x 100注：抗体的百分比面积覆盖率可以以同样的方式推断（例如K14），或作为总伤口面积的百分比。百分比强度还可以提供有关感兴趣标记组织水平表达的半定量信息，而高功率成像则呈现细胞水平的表达数据。